盐酸氨溴索联合环丙沙星抗铜绿假单胞菌成熟生物膜作用研究

　　盐酸氨溴索联合环丙沙星抗铜绿假单胞菌成熟生物膜作用研究李芳余加林杨华李禄全陈波曼【摘要】目的构建铜绿假单胞菌发光菌株，建立铜绿假单胞菌生物膜(biofilm，BF)模型，研究盐酸氨溴索对铜绿假单胞菌成熟BF的影响及与环丙沙星合用是否具有协同杀菌作用。方法将携带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)的质粒转染铜绿假单胞菌，平板培养法培养铜绿假单胞菌BF，建立铜绿假单胞菌BF体外模型，经盐酸氨溴索作用后，扫描电镜(scanningelectronmicroscope，SEM)观察盐酸氨溴索对BF形态结构的影响，荧光显微镜定性观察盐酸氨溴索对BF内活菌的作用，通过发光菌株荧光强度定量分析盐酸氨溴索单独作用以及与环丙沙星联用后BF内活菌量。结果盐酸氨溴索作用后电镜观察可见黏液样物变稀疏，不规则。盐酸氨溴索浓度大于0.49mg/mlBF内活菌数减少(F=18，P0.05)；盐酸氨溴索与环丙沙星存在协同作用(F=15.1，P0.05)，且随着盐酸氨溴索浓度升高协同作用增强。结论盐酸氨溴索破坏铜绿假单胞菌成熟BF形态结构，减少其内活菌数；盐酸氨溴索与环丙沙星存在协同作用，增强其杀菌能力。【关键词】盐酸氨溴索；环丙沙星；铜绿假单胞菌；生物膜ABSTRACTObjectiveToestablishabiofilmmodelofPseudomonasaeruginosainvitroandobservetheeffectofambroxolonbiofilmofPseudomonasaeruginosa,andstudythesynergisticeffectens.MethodPlasmidscarriedonasaeruginosa.PlateculturemethodmodelofPseudomonasaeruginosainvitro.Afterambroxol,theappearanceofthebiofilmicroscope(SEM),andtheviablecountsofbacterialinbiofilmaftertreatedbyambroxolaloneandtogetherinedbybio-fluorescencemethod.ResultAfteraddingambroxol,thebiofilmalparedicroscopeshog/ml,destroyedfurthermore,therebroxolandciprofloxacin(F=15.1,P0.05).Theeffectenhancedbroxol.ConclusionAmbroxoldestroyedfurthermorethebiofilmshapeofPseudomonasaeruginosa,restraineditsgrobroxol;Ciprofloxacin;Pseudomonasaeruginosa;Biofilm 生物膜(biofilm，BF)是细菌黏附在物体表面上形成的一种具有高度结构性的膜状复合物，其主要成分是细菌分泌的胞外基质和细菌菌体〔1〕。BF可使细菌具有抵御宿主免疫系统和抗菌药物杀伤作用，产生对抗菌药物的高度耐药性(可达到浮游状态的10～1000倍)，导致感染难以治愈〔2〕。铜绿假单胞菌是常见细菌生物膜相关感染病原菌之一，铜绿假单胞菌生物膜的形成是呼吸机相关性感染难以控制的重要原因。作者曾研究氨溴索可显著促进环丙沙星对细菌生物膜的透过〔3〕，本研究发现盐酸氨溴索对铜绿假单胞菌BF有抑制作用，且与环丙沙星联用后具有协同作用，增强杀菌活性，现报道如下。　　1材料和方法1.1材料菌株PAO1(购自四川大学微生物实验室)，Luria-Bertani培养基(LB，上海升博生物技术公司)，盐酸氨溴索标准品(德国BoehringerIngelheim)；环丙沙星标准品(重庆市药品检定所)，比浊仪(德国Siemens公司)，多功能酶标仪(美国BIORADUV-3350型)，荧光显微镜(德国Leica公司)，SEM(美国Amary公司)，24及96孔培养板(美国Coring公司)。1.2方法(1)构建GFP标记的PAO1菌株采取电转化对PAO1进行GFP)标记。首先制备感受态PAO1，然后进行菌株pGFPuv质粒转化和转化菌株筛选，提取转化菌株中质粒和转化菌株中质粒双酶切电泳鉴定，检测转化菌株中质粒稳定性。本实验获得较稳定遗传的GFP标记的PAO1菌株。(2)环丙沙星最低抑菌浓度(MIC)的测定采用微量稀释法测定环丙沙星对铜绿假单胞菌的MIC，质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。(3)铜绿假单胞菌BF体外模型的建立用平板法培养铜绿假单胞菌BF〔4〕。取隔夜培养的含有铜绿假单胞菌的LB培养液，调至1.5×108CFU/ml。分别吸取菌液1ml加入24孔板(其内放8mm×8mm玻片)，0.1ml加入96孔板。37℃培养，每48h换液一次，连续培养7d，即可形成稳定成熟的BF〔5〕。(4)铜绿假单胞菌BF形态的SEM检测本部分实验分为两组〔对照组和盐酸氨溴索组(浓度3.75mg/ml)〕。两组用平板法培养细菌7d，在24孔板内分别加入1mlLB培养基和盐酸氨溴索，37℃孵育24h后取出，用磷酸缓冲液(phosphatebuffersolution，PBS)反复清洗，去除浮游菌。立即用2．5%戊二醛PBS溶液中固定2h，再经0.1molPBS冲洗2次(pH7.2)，30%～100%系列浓度乙醇脱水，经50%～100%叔丁醇置换，干燥、离子溅射仪喷金，经过SEM观察铜绿假单胞菌BF微观形态。(5)荧光显微镜定性观察细菌BF内活菌数本部分实验分为6组〔空白对照组，不同浓度的盐酸氨溴索作用组(浓度依次为3.75、1.875、0.95、0.49和0.25mg/ml)〕。在24孔板加入1ml菌液，平板法培养7d，分别加入1ml上述浓度的盐酸氨溴索和LB培养基，37℃ 孵育24h取出，用PBS反复清洗，去除浮游菌，取出玻片，置荧光显微镜下观察。(6)多功能酶标仪定量分析盐酸氨溴索与环丙沙星合用后细菌BF内活菌数细菌培养7d，棋盘法在96孔板内分别加入0.1ml不同浓度的盐酸氨溴索(浓度依次为3.75、1.875、0.95、0.49、0.25和0mg/ml)和环丙沙星(浓度依次为4、2、1、1/2、1/4和0MIC)，37℃孵育24h取出，用PBS反复清洗，去除浮游菌，用多功能酶标仪检测各孔荧光强度。(7)统计学分析所有数据输入SPSS11.5统计软件包，并行正态性分布检验，均符合正态性分布，后进行方差分析，显著性水平α=0.05。2结果2.1环丙沙星的MIC测定环丙沙星的MIC为1μg/ml。2.2SEM观察铜绿假单胞菌BF形态经过各组处理后铜绿假单胞菌BF进行SEM观察可以看出，细菌培养7d后形成成熟的BF。对照组BF在载体表面形成片状物，周围有厚薄不均的黏液状物质连接成一大片，其内包裹大量细菌;盐酸氨溴索处理组铜绿假单胞菌BF变得稀疏，结构简单，仅见少量散在细菌。2.3荧光显微镜观察盐酸氨溴索对成熟BF的影响预置8mm×8mm玻片的24孔板内接种等量的细菌，培养7d后加入不同浓度的盐酸氨溴索作用24h后取出玻片，洗去浮游菌，振荡破坏BF，使其内细菌游出，置荧光显微镜下观察(×200)，取随机视野，结果显示，随着浓度的升高，细菌减少；当浓度达到0.5mg/ml时，与生理盐水对照组大致相当。2.4多功能酶标仪定量检测BF内活菌荧光强度随着盐酸氨溴索浓度的升高，培养板内细菌的荧光强度下降，说明BF内活菌减少，统计分析显示当盐酸氨溴索浓度达到0.49mg/ml时，与对照组存在差异(单因素方差分析，P0.05)。当盐酸氨溴索与环丙沙星联合使用，产生协同效应(双因素方差分析，P0.05)，结果见表1、图1。同时，随着盐酸氨溴索浓度升高，协同作用加强。表1盐酸氨溴索单独以及与环丙沙星联用后BF内细菌荧光强度图1中6条曲线代表不同浓度的盐酸氨溴索作用下，在环丙沙星浓度从0～8MIC变化时荧光强度的变化趋势。从图中可以看出，盐酸氨溴索与环丙沙星存在协同作用(随着盐酸氨溴索浓度升高，在同一环丙沙星浓度所对应的荧光强度，随之降低)，且随着盐酸氨溴索浓度升高，协同作用增强。3讨论 近年来由呼吸机辅助通气的使用增加，导管相关性感染问题日益突出。铜绿假单胞菌是常见的形成BF菌类之一，形成BF后，由于其渗透限制作用〔1〕，以及其内细菌所处的微环境改变〔5〕等原因，导致细菌耐药性增强，难以清除。尽管国外有报道卤代呋喃唑酮〔6〕及藻酸盐抗体〔7〕等有破坏BF的作用，但尚未应用于临床治疗，因此，寻找一种有效可行抗铜绿假单胞菌BF的临床用药具有极为重要的意义。国外报道，化痰药N-乙酰半胱氨酸干扰生物膜形成〔8〕，盐酸氨溴索作为一种临床常用的化痰药与N-乙酰半胱氨酸作用机制上有一定的相似性，推测盐酸氨溴索可能具有抗BF作用。本文将携带GFP的质粒转染PAO1，构建铜绿假单胞菌发光菌株，采用平板培养法，7d后得到成熟的BF。SEM观察显示，在盐酸氨溴索的作用下，成熟的BF变得稀疏，不规则，说明一定浓度的盐酸氨溴索可影响BF的形态，破坏其结构的完整性。同时采用生物发光法直观地观察盐酸氨溴索对铜绿假单胞菌BF内活菌的影响，结果发现随着盐酸氨溴索浓度的升高，BF内黏附的活菌减少，说明盐酸氨溴索对铜绿假单胞菌BF有破坏作用。临床上常用抗生素如环丙沙星对BF状态的铜绿假单胞菌的杀灭作用不强。用多功能酶标仪检测不同浓度环丙沙星与盐酸氨溴索联合应用的对细菌的作用，结果显示它们具有协同抑制作用，且随着盐酸氨溴索浓度升高，协同作用增强，BF内活菌进一步减少，环丙沙星的杀菌活性增强。这可能与盐酸氨溴索破坏BF结构的完整性，增强了环丙沙星对BF的穿透能力，提高了环丙沙星对BF中细菌的杀灭能力。由此认为，盐酸氨溴索对铜绿假单胞菌BF有破坏作用，与其他抗生素联用可以提高其杀菌能力，为盐酸氨溴索的抗BF应用提供了理论基础，为新生儿难治性铜绿假单胞菌感染的临床治疗提供新的思路。对于盐酸氨溴索抗BF的作用推测可能与其对BF胞外基质的合成和结构维持的影响有关，具体机制还有待进一步研究。【