动物生物化学实验讲义

实验讲义（霍金龙老师） 实验一实验基本知识与基本操作，血液样品的处理及组织匀浆的制备实验二考马斯亮蓝法测定蛋白质含量实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察实验四血液葡萄糖的测定（福林—吴宪氏法）实验五核酸的定量测定（紫外吸收法）实验六全血基因组DNA的提取（离心柱型试剂盒提取法）实验七PCR扩增基因实验八琼脂糖凝胶电泳实验九凝胶层析法分离血红蛋白和胰岛素实验十生物化学实验技术理论讲授核酸蛋白层析分离系统实验工作流程一，准备工作1，核酸蛋白检测仪（紫外检测仪）1台2，色谱采集器1套3，自动部分收集器1台4，恒流泵1台5,层析柱1支6，溶液容器和试剂样品二，开机调试1，核酸蛋白检测仪应提前开机半小时预热，然后按仪器使用说明书来调整仪器的透光度，灵敏度，使其稳定在：“100”或“0”上。2，设定自动部分收集器收集样品的所需时间。3，设定恒流泵的所需流量。三，进行实验前的洗脱工作等仪器都设置完成，检测仪工作稳定后，进行样品池实验冲洗，并调整透过率（T100%）和灵敏度A在0.5上检测仪显示读数为“0”（基线）。四，数据采集及计算分析把样品加入层析柱进行实验，并连接电脑（或记录仪），打开信号采集器，打开电脑上装入电脑层析的应用软件，并进行记录保存。然后再对实验所记录的数据进行分析和计算。以上为一个完整的实验操作过程 实验一实验基本知识与操作一.目的1.熟悉实验室规则及常用生化仪器。2.掌握各种仪器的正规操作。3.清点洗刷实验用具。二．实验内容（一）常用生化仪器量器：量筒、容量瓶、吸量管、离心管、微量取液器玻璃仪器容器：烧杯、试管、锥形瓶、滴管仪器：离心机、水浴箱、电泳仪、分光光度计等（二）玻璃仪器的洗涤1、初用的玻璃仪器的清洗：表面附有碱性物质，先用去污粉洗，再用自来水冲洗干净，然后浸于盐酸溶液浸泡过夜，再用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1－2次，80℃烤干备用。2、使用过的玻璃仪器洗涤（1）一般非计量玻璃仪器或粗容量仪器，如烧杯、试管、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1－2次，洗净之器皿倒置干净处晾干或烘箱烤干（量筒不可烘烤）。（2）量器，如吸管、滴定管、容量瓶等先用自来水冲洗，直至不挂水珠，再用蒸馏水冲洗1－2次，风干备用。若冲洗后仍挂水珠，则将其晾干后浸于铬酸洗液浸泡数小时。然后用自来水反复冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1－2次，除吸管可烘干外，其它只能倒置晾干。3、操作：每个人按上述方法刷洗5支试管及烧杯、锥形瓶各1-2个。洗净后请教师检查。（三）吸量管和微量移液器的使用1.吸量管的使用（注意标签、选择容量大小合适的吸量管）（1）正确拿法中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端（2）取液用橡皮球吸液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。（3）调刻度吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。（4）放液吸量管移入准备接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。奥氏吸量管和刻度到底的吸量管应吹出尖端残留的液体。移液管应最后靠壁15秒。2.微量移液器的使用调节体积选取钮至所需值，套上吸头，旋紧。垂直持握移液器，用大拇指按下液体吸放钮至第1档，将吸头插入待吸溶液，松开大拇指使吸放钮回复原位。将移液器移入准备接受液体的仪器，用大拇指再次按下液体吸放钮，至第1档后继续至第2档以排空液体。3.练习吸量管的使用取50ml锥形瓶加入未知酸5ml,酚酞指示剂1滴，摇匀，用0.01mol/LNaOH滴定，记录结果。（无色酚酞遇酸不变色，遇碱变红。）滴定时边滴边摇动锥形瓶。(四)试剂配制：1、溶液浓度表示法（1）重量浓度：有时候溶液的浓度以单位体积溶液中所含溶质的重量来表示。现在规定容量的单位是升（L），所以浓度表示为克/升（g/L）、毫克/升（mg/L）、微克/升（g/L）等。（2）百分浓度：过去习惯用百分含量来表示浓度，但其含意很不清楚，如2％的醋酸可以解释为：每100g溶液中有2g醋酸（W/W），每100ml溶液中有2g醋酸（W/V〕，每100ml溶液中有2ml醋酸（V/V）。（3）摩尔（mol）和摩尔浓度（mol/L）：摩尔浓度是用以表明在每升溶液中所含溶质的摩尔数。1摩尔浓度的溶液为每升溶液中含溶质1摩尔（mol/L）。2、溶液的配制方法（1）百分浓度的配法： a.重量与体积百分浓度（W/V）：即每100ml溶液中含有溶质的克数。如欲配制5%（W/V）NaCl溶液，则称取5gNaCl用少量蒸馏水溶解后，再加水到100ml即可。 b.体积与体积百分浓度（V/V）：即每100ml溶液中含有溶质的毫升数。如欲配制30%（V/V）的醋酸溶液，即用量简量取30ml冰醋酸（含醋酸近100%），加入蒸馏水至100ml。百分浓度的精确度是1/10。所以配制百分浓度溶液时，称量溶质只需要用台秤，溶剂体积用量简量取即可。（2）摩尔浓度溶液配法：例如配制1mol/LNaCl溶液的方法为：已知NaCl的分子量为58.5，即精确称取NaC158.5g，用少许蒸馏水溶解后转入1000ml容量瓶中，最后加蒸馏水至容量瓶刻度，混匀即可。摩尔浓度要求的精确度为1/100。配制时溶质称量应需用1/1000的天平，溶剂体积要用容量瓶定量。（3）溶液浓度的调整：①溶液稀释法：即将已知浓度的浓溶液稀释成所需要某浓度的溶液。其方法是根据浓度与体积成反比的原理进行计算配制：C1V1＝C2V2V1=浓溶液体积c1=浓溶液浓度V2=稀释后溶液体积c2=稀释后溶液浓度例：将6mol/LH2SO4450ml稀释到多少毫升其浓度为2.5mol/L？6450=2.5V2即将6mol/LH2SO4450ml加水稀释到1080ml，则成2.5mol/LH2SO4溶液。②稀溶液调整为浓溶液法：仍按照溶液浓度与体积成反比的原理及交叉法计算。公式为：C（V1+V2）=c2V2+C1V1V1=浓溶液体积C1=浓溶液浓度V2=稀溶液体积C2=稀溶液浓度C=所需溶液浓度例：现有0.25mol/LNaOH800ml，需加多少毫升1mol/LNaOH才能使之成为0.4mol/LNaOH?代入公式：0.4（V1+800）=0.25800+1V10.4V1+320=200+V10.6V1=120V1=200即加入200ml1mol/LNaOH即可使800ml0.25mol/LNaOH成为0.4mol/LNaOH溶液。（4）常用酸碱的摩尔浓度计算实验室中常用的酸Hcl、H2SO4、CH3COOH等及碱NH4OH等都是液体的，试剂瓶上标有比重、浓度（W/W）、分子量等，可以按以下公式计算出摩尔浓度：例：求含量浓度38%（W/W），比重1.19的HCl分子量36.46的摩尔浓度是多少？3、操作：每人各配一个百分浓度，一个摩尔浓度的试剂(五)离心机的使用方法离心机是利用离心力将悬浮液中的微粒从溶液中分离出来的一种仪器。根据最高离心转速的不同可将离心机分为三种类型：普通离心机，其最高转速一般在4000转/分至6000转/分；高速离心机，转速可达10000转/分至25000转/分；超速离心机，转速可超过50000转/分以上。生化实验室常使用普通离心机。普通离心机的使用方法：1．使用前先检查变速旋钮是否在“0”位，外套管是否完整无损和垫有橡皮垫。2．离心时先将待离心的物质转移到大小合适的离心管内，盛量不宜过多,占管的2/3体积为宜,以免溢出。将此离心管放入外套管，再在离心管与外套管间加入缓冲用水。3．将一对装有离心管的外套管在台称上平衡。如不平衡可调整缓冲用水或离心物质的量。4．将平衡好的套管，按对称方位放到离心机插孔中。把不用的离心套管取出，盖严离心机盖。5．接通电源，开启开关，平稳、缓慢移动调速手柄，至所需转速。计时。6．当达到离心所需时间后，将调速柄慢慢调回零位，关闭开关。待离心机自动停止转动后，再打开离心机盖取出样品。7．用完后，取出套管中橡皮垫洗净，冲洗外套管，倒置干燥。（六）实验室常见仪器设备简介：离心机、分光光度计、电泳仪、电子天平、pH计、水浴锅、电热干燥箱等。 实验二考马斯亮蓝法测定蛋白质含量（P78）一、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中某些指示剂的颜色变化，即改变这些染料的光吸收。在此基础上发展了蛋白质染色测定方法。可用的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝（本实验中使用）。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm波长处比色测定。2~5min即呈最大光吸收，至少稳定1小时。10~100μg/ml蛋白质范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性较差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂等对测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英杯测定。二、试剂及器材1．染色液：取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，加双蒸水稀释至1L。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。2．标准蛋白溶液：结晶牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）用蒸馏水配制成1mg/ml浓度。3．样品：经100倍稀释的牛奶。三、操作1．蛋白质标准曲线的绘制管号试剂123456789101112（待测样品）标准蛋白(μl)0102030405060708090100待测样品100双蒸水(μl)10090807060504030201000染色液(ml)555555555555取12支试管编号，按下表加入试剂。混匀，5min后测定各管OD595，并以蛋白浓度为横坐标，OD595值为纵坐标，绘制标准曲线。2．样品测定：100倍稀释牛奶（已稀释好），并于1支干净试管中加入适当量（100μl），按上法测OD值，对照蛋白质浓度标准曲线，求得蛋白含量（或通过回归方程求的），再乘以牛奶稀释倍数，即得原样品浓度。并将之换算为百分浓度。四、思考题1．考马斯亮蓝染色测定蛋白质含量的方法有哪些优缺点？2．采用分光光度法测定某一样品含量时，为什么有时需对样品做稀释？五、注意事项使用的玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，以洗去颜色。附：7200型可见分光光度计的使用方法★1.开机前的检查：开机前打开样品室盖，检查样品室内是否有物品挡在光路上。光路上有阻挡物将影响仪器的自检，甚至造成仪器故障。2.预热：接通仪器电源，预热20～30min后，用波长选择旋钮设置测试所需波长。3.调零：将空白溶液与待测溶液分别倒入比色皿中，把盛有溶液的比色皿放入比色架中（注意比色皿的光面和毛面不要放反），盖上样品室盖，使空白溶液对准光路，用〈MODE〉键选择“T”测试方式，按“100%”键调节光度计读数为“100.0”。用〈MODE〉键选择“A”测试方式，看光度计读数是否为“0.000”。则可以开始测定待测溶液的吸光度值。按mode键，指示灯在T、A、C、F之间跳动（如下表），当指示灯亮点跳到T键，按100，显示“8LR”时，等待，显示100时，按A键，此时吸光度值显示为0。 ●Transmittance●Transmittance●Absorbance●Absorbance●Concentration●Concentration●Factor●Factor4.测定：轻轻拉或推动比色架固定拉杆，使第二个比色皿溶液处在光路中，此时读数即为该溶液的吸光度。（空白管放在靠近测试者一边用拉的方法，且拉杆全部推入仪器内调零；空白管放在远离测试者一边用推的方法，拉杆全部拉出来后调零）5.依次拉或推出第三，第四个比色皿，分别读取溶液的吸光度值。6.测定完毕，先打开样品室盖，再关闭电源。将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。每次都用“0号”做空白对照，即0号管不用动，每次测3管，每测完3管开盖后再测要重新调零，组内测定可以不用洗比色杯，最好先测低浓度，后测高浓度，否则影响实验结果。实验结果举例：管号123456789101112（待测样品）标准蛋白浓度(横坐标，mg/mL)00.10.20.30.40.50.60.70.80.91找出对应横坐标值OD595吸光度(纵坐标)00.2180.5030.5510.6970.6940.8050.8310.9770.9381.031仪器测出注:1mg/mL=1μg/μL=1g/L比如，2号管标准蛋白的实际浓度=（1mg/mL×10μl）/100μl=0.1mg/mL,以此类推在Excel中，选中上面的两行数据，点图标向导，XY散点图，完成后，选中散点，右键，添加趋势线，选项，显示公式，显示R2值，即可作出下图。待测样品计算方法举例：测得的值为0.25mg/mL，因为之前稀释了100倍，所以实际浓度为25mg/mL，也等于2500mg/100mL，可表示为2.5g/100mL（每100mg中牛奶的含量）或表示牛奶中蛋白的含量为2.5%。思考题回答举例：1．考马斯亮蓝染色测定蛋白质含量的方法有哪些优缺点？【考马斯亮蓝法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。但此法所用样品不能回收，不适合需回收样品蛋白的浓度的测定。】 2．采用分光光度法测定某一样品含量时，为什么有时需对样品做稀释？【分光光度计所能测的浓度是在一定范围内的，超出范围，数据就不准确，实验也就没有了意义。假若标曲浓度范围是在0-100mg/L之间，而样品浓度却大于100，这样标曲就不能用来求样品的浓度了，所以这个时候样品就需要稀释。一般情况下，要测的样品浓度都是超过分光光度计的测量范围的，所以就必须得稀释。】预习：下一讲实验：琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察实验三——琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察琥珀酸脱氢酶（Succinicdehydrogenase,SDH）是位于动物细胞线粒体内膜上的一种氧化酶，它直接与电子传递链相连，是呼吸链的标志酶，亦即线粒体或细胞内三羧酸循环的一种标志酶。其活性高低反映出机体细胞呼吸机能状况以及细胞能量代谢状况。SDH在机体不同组织的分布及活性不同，在同一组织的不同生理状态下，SDH的含量、活性也会发生改变。另外，SDH的活性检测在牛奶等级评定等生产实践中也具有重要的意义。【实验内容】观察猪心肌细胞琥珀酸脱氢酶的催化作用。观察猪心肌细胞琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。【实验目的】掌握琥珀酸脱氢酶的催化作用及其意义。掌握酶的竞争性抑制作用及其特点。【实验原理】琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，该酶可使琥珀酸脱氢而生成延胡索酸。在体内，该酶可使琥珀酸脱下的氢进入FADH2呼吸链，通过一系列传递体最后传递给氧而生成水。在缺氧的条件下，适当的受氢体也可接受脱氢酶从底物上脱下的氢，如心肌细胞中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢，脱下的氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白，其反应如下：通过观察蓝色的甲烯蓝变成无色的甲烯白的变化过程，便可判断出琥珀酸脱氢酶起了催化作用。丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它可与琥珀酸竞争性地结合琥珀酸脱氢酶的活性中心。若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为酶的竞争性抑制作用。酶的竞争性抑制作用可以通过加大底物浓度的方法来消除。在本实验中可以通过增加琥珀酸的浓度来减弱甚至消除丙二酸的抑制作用。【材料、试剂与器材】 材料新鲜的猪心脏试剂1.5%（m/V）琥珀酸钠溶液：称取琥珀酸钠1.5g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml。（已配好）1%。（m/V）丙二酸钠溶液：称取丙二酸钠1g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml.0.02%（m/V）甲烯蓝溶液。1/15mol/LNa2HPO4溶液：称取Na2HPO4·2H2O11.8g，用蒸馏水溶解并稀释至1000ml。液体石蜡油，洗净的石英砂。器材天平，离心机，恒温水浴箱，研钵，离心管，剪刀等。【实验步骤】猪心脏提取液（琥珀酸脱氢酶溶液）的制备称取2g新鲜的猪心脏组织，置于研钵中并充分剪碎，加入等体积的石英砂和1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml，研磨成匀浆，再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液，放置30min（需要不时的摇动！！！），然后以2000r/min离心10min，取上清液（琥珀酸脱氢酶溶液）备用。猪心肌细胞琥珀酸脱氢酶的酶促化学反应的观察取4支试管，按照下表操作。单位：滴试管号心脏提取液1.5%琥珀酸钠1%丙二酸钠蒸馏水0.02%甲烯蓝155-25225（煮沸）5-25231055152410205-2各试管加好试剂后，混匀（！！！），立即在各试管的液面上轻轻地覆盖一层1-1.5cm高的液体石蜡油；然后，将各试管置于37℃恒温水浴中保温，观察并记录各管颜色变化快慢及程度（观察实验现象的过程中，切勿摇动！！！），并分析其原因。然后将第1支试管用力摇动，观察有何变化。记录并解释之。【注意事项】各试管覆盖液体石蜡油前，一定要将其中的反应液充分混匀；覆盖液体石蜡油后，观察实验现象的过程中，切勿摇动，以免氧气漏入而影响管内溶液的颜色变化。研磨心脏组织时，一定要充分研磨成匀浆；加入1/15mol/LNa2HPO4溶液后，放置30min时，一定要不时的摇动，以使琥珀酸脱氢酶从线粒体内释放出来。【思考题】本实验过程中，加液体石蜡油的目的是什么？各管颜色变化快慢及程度有何不同？为什么？当第1支试管由蓝色变为无色时，再用力摇动，观察有何变化？为什么？预习：下一讲实验：血糖的定量测定技术 实验四血液葡萄糖的测定（福林—吴宪氏法）一、原理葡萄糖（C6H12O6）是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，OOHOH与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基（—C)被氧化成羧基（—C)，而铜试剂中的二价铜（Cu++），被还原成砖红色的氧化亚铜（Cu2O）而沉淀。氧化亚铜可使磷钼酸还原生成钼蓝，使溶液呈蓝色。其生成蓝色的深浅与血滤液中葡萄糖浓度成正比。选用颜色深浅较接近于测定管的标准管一同比色，即可求出测定管中葡萄糖的含量。福林—吴宪氏法测定血糖是在特制福林—吴宪血糖管中进行。该血糖管于4ml容量处，管颈缩小成一细管状，这样可以减少在煮沸时管内液体与空气的接触，以避免产生的亚铜再氧化。二、试剂及器材1．10%草酸钾抗凝剂：称10g草酸钾加入蒸馏水溶解定容至100ml，80℃烘箱中烘干（不能温度太高，超过150℃就分解）。2.1/3mol/L硫酸溶液：取浓硫酸（比重1.84）17.77ml，加入到约500ml蒸馏水中，再定容至1000ml。用0.1mol/LNaOH标定，调整至1/3mol/L。3．10%钨酸钠溶液：将钨酸钠（Na2WO4·2H2O）10g溶于蒸馏水，使全量至100ml（此液呈弱碱性，取10ml用0.1mol/LHCL溶液滴定，达中和时约需0.1mol/LHCL0.4ml)。4．碱性铜试剂：取无水碳酸钠40g溶于约400ml蒸馏水中；酒石酸7.5g溶于约300ml蒸馏水中，结晶硫酸铜4.5g溶于200ml水中，分别加热助溶。冷却后，将酒石酸溶液倾入碳酸钠溶液中，混匀，移入1，000ml容量瓶中，再将硫酸铜溶液倾入并加蒸馏水至刻度。混匀，贮存于棕色瓶中。5．磷钼酸试剂：取钼酸（HMoO4）70g和钨酸钠10g，加入10%NaOH溶液400ml及蒸馏水400ml，混合后煮沸20-40分钟，以除去钼酸中存在的氨（直至无氨味为止），冷却后加入浓磷酸（80%）250ml，混匀，最后以蒸馏水稀至1,000ml。6．0.25%苯甲酸溶液：称125mg苯甲酸溶于蒸馏水（加热助溶解），定容至50ml7．葡萄糖贮存标准液（10mg/ml）：将少量无水葡萄糖（A.R）置于硫酸干燥器内过夜。精确称取此葡萄糖1.0g，以0.25%苯甲酸溶液溶解并转入100ml容量瓶内，再以0.25%苯甲酸溶液稀释至100ml刻度。置冰箱中可长期保存。8．葡萄糖应用标准液（0.1mg/ml）：准确吸取葡萄糖贮存标准液1.0ml，置100ml容量瓶内，以0.25%苯甲酸溶液稀释至100ml刻度，用后4℃保存。三、操作1．用钨酸法制备1:10全血无蛋白滤液（总体积10ml）①吸取充分混合的抗凝鸡血1ml到50ml锥形瓶。②加入蒸馏水7ml，混溶，使完全溶血。③加入1/3mol/LH2SO4溶液1ml，随加随摇④加入10%钨酸钠1ml,随加随摇⑤用玻璃小漏斗和滤纸直接过滤，即得完全澄清无色之无蛋白滤液。2．取4支血糖管按下表操作： 单位：ml血糖管试剂（ml）空白管低浓度标准管高浓度标准管测定管无蛋白滤液（待测样品）---1.0蒸馏水2.01.0-1.0标准葡萄糖应用液-1.02.0-碱性铜试剂2.02.02.02.0混匀，置沸水浴中煮8min。取出用流动自来水冷却3min(切勿摇动血糖管)磷钼酸试剂2.02.02.02.0混匀后放置2min（使二氧化碳气体逸出）蒸馏水加至25252525蒸馏水加至25刻度处后，用橡皮塞塞紧管口颠倒混匀，用空白管调“0”点，在420nm波长处进行比色，读取并记录各管光密度值。3．计算：测定管浓度=OD测定管光密度标准管浓度OD标准管光密度测定管浓度=OD测定管光密度×标准管浓度OD标准管光密度已高浓度标准管计算的葡萄糖含量：葡萄糖含量（mg/100ml）OD测定管光密度×0.2×100OD标准管光密度0.1已低浓度标准管计算的葡萄糖含量：葡萄糖含量（mg/100ml）OD测定管光密度×0.1×100OD标准管光密度0.1注意事项[1]血滤液内除葡萄糖外尚含有其它还原性物质（约占10-20%）。用此法测得之血糖含量较实际葡萄糖含量稍高。[2]一定要等水沸后，再放入血糖管。准确加热8分钟，时间过久，呈色较深，反之则浅，均影响结果的准确性。[3]血糖管下部的管径较细，以避免还原生成的亚铜被空气中的氧再氧化，降低实际结果。同理，冷却时切不可摇动血糖管。[4]加入磷钼酸试剂后显颜并不稳定，故应迅速进行比色。四、思考题1.简述福林—吴宪（Folin-Wu）氏法测定血糖的原理。2.血糖管的结构有何特点？使用时应注意什么？3.测定血糖为何用无蛋白滤液,而不用全血？4.测定血糖中福林—吴宪（Folin-Wu）氏法有何优缺点？ 实验五核酸的定量测定（紫外吸收法）核酸定量测定技术包括紫外分光光度法、定磷法、定糖法三种。紫外分光光度法是目前使用方便、准确、快捷的常用方法，采用紫外分光光度法可以测定核酸的浓度和纯度，有微量紫外分光光度计可供使用。定磷法和定糖法已不太常用，定磷法可测定磷酸从而计算核酸的含量，定糖法通过测定核糖或脱氧核糖可测出DNA或RNA的含量。一、主要内容利用紫外分光光度计在260nm处测定核酸含量。本实验室为双光束紫外-可见光分光光度计，型号为UV4802。二、目的要求1.了解紫外分光光度计的基本原理并掌握其使用方法。2.掌握使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和方法。三、实验原理核酸中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双键系统（—C=C—C=C—），能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光。核酸（DNA或RNA）的最大吸收峰在260nm波长处，不同浓度的核酸含量其在260nm的紫外吸收不一样，因而可以从紫外吸收的变化来测定核酸物质的含量。核酸和核苷酸的摩尔吸光系数用ε（P）表示。ε（P）为每升溶液中含有1摩尔核酸磷时的吸光度（即光密度，或光吸收）。RNA的ε（P）为7700～7800，RNA中磷的质量分数约为9.5％，因此浓度为1.0μg/ml的RNA溶液其吸光度为0.022～0.024。小牛胸腺DNA钠盐的ε（P）（260nm，pH7）为6600，含磷的质量分数为9.2％，因此浓度为1.0μg/ml的DNA溶液其吸光度为0.020。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的吸光度A260值，即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便、迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测光误差较大，应设法事先除去。不同形式DNA紫外吸光度不同，因为DNA具有双螺旋结构，当过量的酸、碱或加热使DNA变性，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加，即ε值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在260nm处测量。在核苷酸量相同情况下，ε（P）260nm有以下关系：单核苷酸＞单链DNA＞双链DNA。DNA变性后，双螺旋结构被破坏，碱基充分暴露，导致紫外吸光度增加，故可根据DNA溶液在260nm处吸光度的变化监测DNA变性情况。在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时ε（P）260nm值又明显减少，回复到原来的核酸分子ε值较低的水平，即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。蛋白质由于含有芳香氨基酸，也能吸收紫外光。蛋白质的吸收峰在280nm波长处，在260nm处的吸光度仅为核酸的1/10或更低，因此核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的A260nm与A280nm之比在2.0以上，DNA的A260nm与A280nm之比为1.9左右（该比值在1.8-2.0之间表示DNA样品较纯）。当样品中蛋白质含量较高时该比值会下降。因此，可用此法检验核酸样品的纯度。紫外吸收法测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达3ug/ml的检测水平。以下分别就紫外分光光度计测定核酸含量的三种不同方法予以阐明。他们分别是标准曲线法、标准管法、磷的消光系数法（公式法）。 四、材料及试剂1.试剂：（1）1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.0）：（2）0.5mol/L的EDTA(pH8.0)溶液：以水代替（3）TE缓冲液（pH8.0）：（4）标准DNA溶液：100μg/ml（0.1mg/ml），称取鲱鱼精DNA0.1g溶解到1L缓冲液中（水）中，（5）待测DNA样品液2.器材：（1）UV-4802型紫外分光光度计（上海尤尼柯公司）。（2）石英比色皿，一套2只。（3）刻度吸管（1ml、2ml、5ml、10ml）、微量可调移液枪及枪头、试管、试管架、烧杯、洗瓶、废液缸、培养皿、卫生纸、擦镜纸、漩涡混合器等。五、方法与操作步骤1.标准曲线法(1)DNA标准曲线的制作：取7支干燥洁净试管，按下表加入各种试剂：试管01234567（待测管）标准DNA溶液（ml）00.61.21.82.43.03.6TE缓冲液（ml）65.44.84.23.63.02.4标准DNA溶液浓度（μg/ml）0102030405060A260比如1号管浓度计算方法：1号管DNA浓度=100μg/ml×0.6ml=10μg/ml6ml将各管溶液在漩涡混合器上混匀，以0号试管为空白在紫外分光光度计上测定各管260nm处的吸光度值A，以标准DNA溶液的浓度值为横坐标，A为纵坐标拟合标准曲线。（2）未知样品的测定：取未知样品约4ml倒入石英比色杯中，仍以0号管为空白，在260nm处测定其吸光度值，对照计算机上自动拟合成的标准曲线可自动求出其浓度值。2.标准管法OD测定管/OD标准管=C测定管/C标准管则C测定管=OD测定管/OD标准管×C标准管测定管浓度C=OD测定管光密度标准管浓度COD标准管光密度测定管浓度C=OD测定管光密度×标准管浓度OD标准管光密度任选一个浓度和未知样品接近的标准品用标准管法进行计算（例如取2号管），将结果和标准曲线法相对比。如：测定管浓度C=OD测定管光密度×20μg/mLOD标准管光密度 3.消光系数法（公式法）将样品配制成每毫升含5～50μg的核酸溶液，于紫外分光光度计上测定260nm的吸光度，按下式计算核酸浓度和两者的吸收比值：DNA的质量浓度（ug/mL）=A260×稀释倍数0.020×L注：本实验中直接测DNA的浓度，稀释倍数为1RNA的质量浓度（ug/mL）=A260×稀释倍数0.024×L式中：A260—260nm波长处的光密度读数。L—比色杯的厚度，一般为1cm或0.5cm，本实验用的是1cm0.024—每毫升溶液内含1.0μgRNA的光密度值。0.020—每毫升溶液内含1.0μgDNA钠盐时的光密度。六、注意事项1．测定样品DNA含量时，内含DNA量应调整至标准曲线的可读范围内。2．石英比色杯使用时需小心，避免损坏。使用完毕后先用自来水内外冲洗干净，再用蒸馏水将比色杯内外表面冲洗干净，将其粗糙面朝下放于培养皿中。3．切勿将溶液洒落于分光光度计比色室内。七、思考题1．使用紫外分光光度计时应该注意什么？2．使用比色皿时有何注意事项？3．紫外吸收法如何测定核酸含量？4．如果测定核酸含量时，样品中混有大量的核苷酸或蛋白质等吸收紫外光的物质，是否需要处理？附：UV4802紫外分光光度计使用方法1.UV-VisAnalyst打开后，右下角“就绪”，如显示“未联机”，此时在uv4802上选“pressESCtoskip”→systemcalibration?No→Enter即“就绪”。2.创建定点测量：文件→创建（定点测量）→建立测量方法（R建立标线，R计算样品浓度）可先建立一点测量方法，波长1选“260nm”，仪器面板上应能显示出260nm，“拟合参数”选“选线性拟合”。3.点开标准样品选项，在2个比色皿中先放入参比液，将2个比色皿放入参比光路和样品光路（2点法矫正，2管同时调零，），校满刻度，调零，在右下侧波长显示“260nm”吸光度显示“0.0000”，后边测时留里边的管，用外边的管重测。4.取出样品光路中的比色皿，用蒸馏水洗干净后，加入0号管中试剂，→点击标准样品选项，点“启动”，依次测量标准品A260值，同时输入其相应的C值，点“启动”，则跳出一个结果小对话框，吸光度A260值可显示出来，要求手动输入0号管标准样品浓值“0”，按确定值，则该结果加入标准样品列表中。5.将标准品比色杯取出，冲洗干净后加入1号管中试剂，重复上面步骤。6.依次测定1-6号管中标准DNA的A260值并输入相应的已知浓度值确认。 1.标准品测定完毕后，点击拟合曲线，电脑自动生成浓度和吸光度标准曲线。在显示范围中输入曲线相关信息，如标线名称，实验者，标线浓度单位，并调整X轴、Y轴显示范围和上下限。X轴上限设为80，Y轴上线设为1.5，X间距10，Y轴间距0.22.此时可测量未知样品：将样品光路中的样品取出，倒回原试管，将待测的未知浓度样品放入样品光路，在打开的标准模式下测量样品A260值，同时浓度值也计算了出来。计算公式根据上述的拟合曲线出来的标准曲线自动生成。点击“样品测量”选项，换入待测样品进行测量，→记录，保存实验结果，保存在“动物生化实验室”文件夹中。显示设置中换单位为μg/ml测量方法中根据260和280值需要，更改选项。当保存的样品不能打开时，还要新建立一个定点测量才能打开。“是否建立标准曲线”一定要打勾R，否则“标准样品”按钮不可用。实验六全血基因组DNA的提取（离心柱型试剂盒提取法）一、实验原理DNA是所有生物体的基本组成物质，真核生物DNA主要存在于细胞核中，以核蛋白的形式存在，因此制备DNA必须先粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，核蛋白方能释放出来。再除去蛋白质、脂类、糖类和RNA等物质，得到纯化的DNA。其原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持DNA分子的完整性。SDS和蛋白酶K的应用使这两个原则得到了保证。在提取DNA的反应体系中，SDS（十二烷基硫酸钠）破坏细胞膜和核膜（溶解膜蛋白），使蛋白质变性，将核蛋白中的DNA与蛋白质分开，并抑制细胞中的DNase的活性。蛋白酶K可降解所有的蛋白，抑制DNase的降解作用，使DNA分子尽量完整地分离出来。在本实验中，独特的结合液CB和蛋白酶K能迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱下来。提取出的DNA制品可进一步加以鉴定。DNA提取可用于基因诱变、DNA克隆及DNA测序、PCR扩增等。二、试剂与器材：1、试剂：全血DNA提取试剂盒（北京百泰克公司）；抗凝剂ACD。2、器材：高速离心机、冰箱、高压灭菌锅、水浴锅、移液枪、离心管等。三、操作步骤：（以200ul全血提取举例）1、取200μl新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，放入1.5mL离心管（如果全血起始量小于200μl，则用缓冲液BB补足至200μl；如果起始量介于200~300μl之间，则后操作需要按照比例增加试剂用量；如果起始量介于300ul~1ml之间，则需要先进行红细胞裂解操作）。2、加入200μl结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，再加入20μl蛋白酶K（20mg/ml），颠倒轻摇充分混匀，70℃放置10分钟，每隔2分钟颠倒混匀几次，之后溶液应变清亮，颜色偏黑色。3、加入100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。上述操作步骤中适当力度混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以旋涡振荡15秒混匀，但不可剧烈振荡，以免剪切DNA，之后4℃冷却5-10min。4、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中），10000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 5、加入500ul抑制物去除液IR，12000rmp离心30秒，弃废液。6、加入700ul漂洗液WB，12000rmp离心30秒，弃废液。7、加入500ul漂洗液WB，12000rmp离心30秒，弃废液。8、将吸附柱AC放回空收集管中，13000rmp离心2分钟，尽量去除漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。9、取出吸附柱AC，放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB洗脱（缓冲液事先在65-70℃水浴中预热），室温放置3-5分钟，12000rmp离心1分钟。收集离心得到的液体，将所得的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rmp离心1分钟，得到DNA溶液。10、取部分DNA用琼脂糖凝胶电泳鉴定。其余DNA溶液可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。注意事项：1.异丙醇、漂洗液WB、抑制物去除液IR实验前应置于4℃冰箱。2.洗脱缓冲液EB使用前应置于70℃水浴锅中预温。3.转移DNA时不要用枪头反复吹吸，混匀不可太剧烈，处理前须将血液标本恢复至室温。实验七PCR扩增基因一原理聚合酶链反应——PCR是一种体外基因扩增技术，是在引物和四种脱氧核苷三磷酸存在下，利用DNA聚合酶反复作用，使微量的特定片段得以大量扩增的反应过程。PCR反应过程：变性94˚C延伸72˚C退火50-60℃每三步为一个循环，每循环一次，使模板DNA拷贝数增加1倍，理论上讲，30个循环后，扩增产物为230拷贝二试剂及器材1、试剂（1）10×reactionbuffer：500mmol/LKCl,100mmol/LTris-HCl(pH8.3)，0.1%明胶等。（2）MgCl2溶液：25mmol/L（3）dNTPs：2.5mmol/LdATP，2.5mmol/LdCTP，2.5mmol/LdGTP，2.5mmol/LdTTP。（4）Taq酶（5U/μL）（5）DNA模板（6）引物溶液（10μmol/L）：包括ForwandPrimer和ReversePrimer两种。2、器材PCR仪，涡旋混合器，手掌离心机 三操作1、在0.2mlEppendorf管内配制25ul反应体系（原体系）：反应物体积（μl）ddH2O18.510×PCR缓冲液2.52.5mmol/LdNTP0.525mmol/LMgCl21引物1（F）0.5引物2（R）0.5模板DNA1Taq酶0.5现体系：反应物体积（μl）ddH2O9.52×Premix12.5引物1（F）0.5引物2（R）0.5模板DNA2石蜡油10μl旋涡混合器混合，短暂离心之后将样品放入PCR仪。2、按下述程序进行扩增（1）95℃预变性5min；（2）94℃变性30s；（3）55℃退火30s；（4）72℃延伸30s；（5）重复步骤（2）—（4）35次；（6）72℃后延伸10min；（7）4℃保存。四、PCR常见的问题及解决办法常见的问题解决办法假阴性模板模板中蛋白质没有去除干净保证模板的数量及质量模板中含有Taq酶抑制剂模板在制备过程中丢失过多反应体系酶的活性低选择高质量的酶,尽量减少运输时间引物设计不合理及浓度过低，Mg2+浓度过低合理设计引物,摸索出最佳的引物浓度和Mg2+浓度循环参数设置变性温度过低，时间过短退火温度过高提高变性温度，延长变性时间，降低退火温度Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度 出现非特异性扩增带降底酶量提高退火温度合理设计引物引物设计不合理退火温度过低酶量过多出现片状拖带模板量相对过少增加模板量实验八琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA一实验原理将两个电极插在电解质溶液中，通上直流电，正离子则向负极移动，而负离子向正极移动，这种现象就是我们熟悉的电泳现象，也称“电泳”。概括而言，电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。各种电泳技术具有以下特点：①凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析；②样品用量极少；③设备简单；④可在常温进行；⑤操作简便省时；⑥分辨率高。本实验采用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA。琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2~20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子或片段泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外（电荷效应），还与DNA分子的大小和空间构象有关（分子筛效应）。DNA的相对分子质量越大，其电泳的迁移率就越小。共价闭环DNA（covalentlyclosedcircular，cccDNA）>直线DNA>开环的双链环状DNA。琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅0.5～1μg，超薄平板型琼脂糖凝胶所需样品DNA量可以更低。凝胶浓度与被分离DNA样品的相对分子质量成反比关系，一般常用的凝胶浓度为1％～2％。在电泳的形式上常用平板型电泳，因为平板型电泳可将多个样品和标准相对分子质量DNA放在同一块胶上进行电泳，使各样品在相同的条件下进行电泳，便于相互间的比较。电泳时，用溴酚蓝示踪DNA样品在凝胶中所处的位置，但每种DNA样品所处的准确位置需要用新型核酸染料GoldView对DNA分子进行染色才能确定。在紫外光的激发下发出绿色荧光。琼脂糖凝胶电泳具有下列优点：（1）琼脂糖含液体量大，可达98～99％，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微。（2）琼脂糖作为支持物有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3）电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作检测。（5）区带易染色，样品易回收，有利于制备。二试剂与器材1、试剂：（1）50×TAE缓冲液：称取Tris碱242g，量取57.1ml冰醋酸及200ml0.5mol/L的EDTA溶液，用蒸馏水加至1L。（2）1×TAE缓冲液（pH8.1）：将50×TAE缓冲液用蒸馏水稀释50倍。用作电泳缓冲液和配制琼脂糖凝胶。（3）1%的琼脂糖溶液：称取1g琼脂糖，加入100ml1×TAE缓冲液，微波炉加热熔化。（4）核酸染料GoldView（北京赛百盛基因技术有限公司）。（5）6×loadingbuffer（含溴酚蓝和二甲苯氰FF）。（6）DNAmarker（北京全氏金公司）。2、器材：电泳仪（Bio-Rad公司）、电泳槽（北京六一）。三实验步骤 配制足量的电泳缓冲液（1×TAE或0.5×TBE）用以灌满电泳槽和配制琼脂糖凝胶。根据欲分离DNA片段大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉加到三角烧瓶中。（配制1%的琼脂糖溶液100ml）。用牛皮纸松松地盖住三角烧瓶口，在沸水浴或微波炉（火力40，时间：新胶5分钟，旧胶3分钟）内加热至琼脂糖熔化。待熔化的凝胶稍冷却后（不烫手）加入3ulGoldView核酸染料。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。琼脂糖溶液正在冷却时，用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置应在托盘底面上0.5-1.0mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。让凝胶溶液完全凝结（室温下30-45min）。加少量电泳缓冲液于凝胶顶部，小心拔出梳子。倒出电泳缓冲液，将凝胶安放到电泳槽内。向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。9、取出DNA溶液5ul并加1ul的6×loadingbuffer（凝胶加样缓冲液），混匀。10、用微量移液器及一次性吸头将样品混合液（5ulDNA提取液+1ul6×loadingbuffer）缓加至凝胶的加样孔内。DNAmarker加至样品孔最左侧的一个孔内。11、关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA应向阳极（红色插头）侧泳动。给予1-5V/cm的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准（电压调至130v左右）。如电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡，并且几分钟内溴酚蓝从加样孔迁移进入胶体内。待溴酚蓝和二甲苯氰FF迁移到适当距离（胶的中部）后再停止电泳。12、当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源，拔出电极插头和打开电泳槽盖。紫外灯（凝胶成像系统）下观察结果，拍照。附：琼脂糖凝胶电泳操作注意事项：1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。  3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。 实验九凝胶层析法分离血红蛋白和胰岛素一实验原理凝胶层析（gelchromatography）又称为凝胶过滤（gelfiltration）、分子筛层析（molecularsievefiltration ）、凝胶渗透层析（gelpermeationchromatography）等。主要根据混合物中分子的大小和形状不同，在通过凝胶时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构，小分子易进入凝胶网孔，流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间隙流动，流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。被分离物质可按分子的大小不同分开。凝胶层析原理示意图用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose，Agarose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等及这些凝胶的衍生物。本实验主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1-氯-2、3-环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G-10至G-200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G-25即表示吸水量为2.5ml/g干胶。市售有G-10，G-15，G-50，G-75，G-100，G-150，G-200等型号。G-75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G-75以下的称为硬胶。葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖凝胶基本上不带电荷、呈隋性，不与被分离物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的中性盐作洗脱液。二试剂与器材1.葡聚糖凝胶：SephadexG-752.1mol/L的Na2HPO4储备液：称取358.14gNa2HPO4·12H2O溶于蒸馏水后定容到1L；1mol/L的NaH2PO4储备液：称取156.01gNaH2PO4·2H2O溶于蒸馏水后定容到1L。3.洗脱液：0.1mol/L，pH6.8磷酸盐缓冲液。取1mol/L的Na2HPO4储备液46.3ml和1mol/L的NaH2PO4储备液53.7ml混合，将100ml混合的1mol/L储备液混合物，加蒸馏水稀释至1000ml，即得到pH6.8的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。 4.待分离样品：胰岛素（Insulin）、血红蛋白（Hemoglobin）。5mg/mL血红蛋白：称取0.05g血红蛋白加入10ml的胰岛素液（一个包装量）中，摇匀。5.1.5×20cm层析柱6.核酸蛋白检测仪7.恒流泵8.自动部分收集器9.电脑数据采集器三实验操作1．凝胶的处理（由实验室准备）2．装柱将层析柱垂直固定在支架上，待气泡排除后，使溶液在底端留至约1cm高即可关闭。将溶胀好的凝胶放在烧杯中用1倍的洗脱液搅调悬浮液，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积至1-2cm时，缓缓打开底部出口管，随之继续加入凝胶悬浮液至柱床高度时（本实验达17cm），立即关闭下口，待凝胶自然沉降。凝胶柱床一般离柱顶3-5cm，覆盖一层溶液。凝胶悬液尽量一次加完，以免出现不均匀或分层的凝胶带。如表层凝胶凸凹不平或胶床出现分层及纹路等毛病，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，使表面平整。刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶会产生大量的气泡影响层析。在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气再加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。3．平衡柱装好后，使层析床稳定5-10分钟，然后接上恒流泵，打开出口，用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶柱，使层析床稳定。4．上样和洗脱加样时先将柱的出口打开，让凝胶柱面上的溶液逐渐流出，待胶面上只留下极薄的一层液体时，关闭出口。用滴管将样品（约0.8ml）小心地加到凝胶床的表面上。注意加样时不要将床面冲起，亦不要沿柱壁加入。然后，打开出口，使样品恰好进入床面(不要让空气进入床内)。关闭下口，用少量洗脱液同样小心清洗表面1-2次，打开下口，待洗脱液完全流进床内后，打开恒流泵，将洗脱液泵入胶床进行扩展洗脱，控制流速为0.5ml/min左右，直至分子量不同的样品逐步分开并先后由柱床流出为止。注意胶床表面始终要保留一层薄的液体，否则空气容易进入而使胶床开裂。5．收集样品柱层析分离蛋白质或核酸时，可以采用核酸—蛋白检测仪监测，它在记录仪的记录纸或电脑上能自动绘出洗脱曲线，收集洗脱峰内的液体。洗脱下来的样品也可以用部分自动收集器收集，使一些需时较长的柱层析操作方便多了。 若没有核酸—蛋白检测仪，可用以下方法监测。蛋白质的检测：由收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入1滴20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋白质出现，直到检查不出白色沉淀时，停止收集洗脱液（注意在检测时，用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净，再吸取下一管，以免造成相互污染）附录：凝胶的洗涤及保存由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用，所以无需“再生”，只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢，所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。凝胶暂时不使用可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室温保存应加入0.02%叠氮钠（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂，以防发霉。用时以水洗去防腐剂即可使用。凝胶长期不用，可用水洗净，分次加入百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使之平衡，再换一下浓度的乙醇，让凝胶逐步脱水，再用乙醚除乙醇，抽干即可。或将凝胶洗净后抽干，在表面皿上30℃逐步烘干。实验十动物生物化学实验室安全与防护知识就人身安全而言，着火、爆炸、中毒、触电、外伤和生物伤害等是动物生物化学实验室易发的高危险性安全事故。下面分别简要介绍之。2.1着火  由于实验的需要，一方面，生化实验室中经常使用电炉、微波炉等火（热）源，另一方面又经常大量使用有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等，因此，稍加不慎极易发生着火事故。常用有机溶剂的易燃性列于表2-1。表2-1. 常见有机液体的易燃性名 称   沸点（℃ ）    闪点（℃ ）  自燃点（℃）乙  醚     34.5          －40          180丙 酮     56          －17          538二硫化碳     46          －30         100苯      80          －11550乙醇（95％） 78            12         400注:闪点：液体表面的蒸汽和空气的混合物在遇明火或火花时着火的最低温度。自燃点：液体蒸汽在空气中自燃时的温度。由上表可以看出，乙醚、二硫化碳、丙酮和苯的闪点都很低，因此不得存于可能会产生电火花的普通冰箱内。低闪点液体的蒸汽只需接触红热物体的表面便会着火，其中二硫化碳尤其危险。火灾对实验室的打击最严重，最直接，占总事故的44.7％；引起实验室失火的主要物品有电热仪器、易燃物、助燃物、点火能源等；2.1.1预防火灾必须严格遵守以下操作规程（1）加热易燃物不能用明火，只能用水浴或加热套加热，且在通风橱内进行。（2）废有机溶剂不得倒入废物桶，只能倒入回收瓶，以后再集中处理。量少时用水稀释后排入下水道（有条件的实验室应避免这样做）。（3）不得在烘箱内存放、干燥、烘焙有机物。在有明火的实验台面上不允许放置开口的有机溶剂或倾倒有机溶剂。（4）挥发性物品（如乙醚等）不能放入普通冰箱中，以防止其挥发后遇冰箱电火花爆炸。（5）高压气体要分类，直立，严禁氯气和氨气，氢气和氧气等放在一个房间，应相距10m以上距离。2.1.2灭火方法 实验室中一旦发生火灾切不可惊慌失措，要保持镇静，根据具体情况正确地进行灭火或立即报火警（火警电话119）。自己扑灭不了的一定迅速报火警。力不能及的情况下一定要撤出，有浓烟时应贴地面逃出门外，关上防火门。外逃时千万不能使用电梯，假如困在室内，应尽量准备充足的水，打湿毛巾，衣服以备用。灭火方法：破坏能引起燃烧的因素，可采用：隔离法、冷却法、窒息法、化学中断法。实验室可用水、砂土、灭火器等。具体来说，可分为以下几种:（1）容器中的易燃物着火时，用灭火毯盖灭。因为已经确证石棉有致癌性，故改用玻璃纤维布作灭火毯。（2）乙醇、丙酮等可溶于水的有机溶剂着火时可以用水灭火。汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时不能用水，只能用灭火毯和砂土盖灭。（3）导线、电器和仪器着火时不能用水和二氧化碳灭火器灭火，应先切断电源，然后用1211灭火器（内装二氟一氯一溴甲烷）灭火。（4）个人衣服着火时，切勿慌张奔跑，以免风助火势，应迅速脱衣，用水龙头浇水灭火，火势过大时可就地卧倒打滚压灭火焰。2.2爆炸生物化学实验室防止爆炸事故是极为重要的，因为一旦爆炸其毁坏力极大，后果将十分严重。生物化学实验室常用的易燃物蒸汽在空气中的爆炸极限（体积％）见表2-2。加热时会发生爆炸的混合物有：有机化合物～氧化铜、浓硫酸～高锰酸钾、三氯甲烷～丙酮等。表2-2. 易燃物质蒸汽在空气中的爆炸极限名称  爆炸极限（体积百分数）  名称  爆炸极限（体积百分数）乙醚    1.9～36.5        丙酮    2.6～13甲醇    6.7～36.5        乙醇    3.3～19氢气    4.1～74.2        乙炔    3.0～8引起爆炸事故的常见原因如下：①随意混合化学药品，并使其受热、受摩擦和撞击。②在密闭的体系中进行蒸馏、回流等加热操作。③在加压或减压实验中使用了不耐压的玻璃仪器，或反应过于激烈而失去控制。④易燃易爆气体大量逸入室内。⑤高压气瓶减压伐摔坏或失灵。⑥用微波炉加热金属物品。2.3中毒生化实验室常见的化学致癌物有：石棉、砷化物、铬酸盐、溴化乙锭、芳香化合物、丙烯酰胺等。剧毒物有：氰化物、砷化物、乙腈、甲醇、氯化氢、汞及其化合物等。中毒的原因主要是由于不慎吸入、误食或由皮肤渗入。2.3.1中毒的预防（1）保护好眼睛最重要，使用有毒或有剌激性气体时，必须配戴防护眼镜，并应在通风橱内进行。（2）取用毒品时必须配戴橡皮手套。  （3）严禁用嘴吸移液管，严禁在实验室内饮水、进食、吸烟，禁止赤膊和穿拖鞋。（4）不要用乙醇等有机溶剂擦洗溅洒在皮肤上的药品。2.3.2中毒的急救方法（1）误食了酸和碱，不要催吐，可先立即大量饮水，误食碱者再喝些牛奶，误食酸者，饮水后再服Mg(OH)2乳剂，最后饮些牛奶。（2）吸入了毒气，立即转移室外，解开衣领，休克者应施以人工呼吸，但不要用口对口法。（3）砷和汞中毒或中毒严重者应立即送医院急救。2.4触电生物化学实验室要使用大量的仪器、烘箱和电炉等，因此每位实验人员都必须能熟练地安全用电，避免发生一切用电事故，当50HZ的电流通过人体25mA电流时呼吸会发生困难，通过了100mA以上电流时则会致死。2.4.1防止触电（1）不能用湿手接触电器。（2）电源裸露部分都应绝缘。（3）坏的接头、插头、插座和不良导线应及时更换。 （4）先接好线路再插接电源，反之先关电源再拆线路。（5）仪器使用前要先检查外壳是否带电。（6）如遇有人触电要先切断电源再救人。2.4.2防止电器着火（1）保险丝、电源线的截面积、插头和插座都要与使用的额定电流相匹配。（2）三条相线要平均用电。（3）生锈的电器、接触不良的导线接头要及时处理。（4）电炉、烘箱等电热设备不可过夜使用。（5）仪器长时间不用要拔下插头，并及时拉闸。（6）电器、电线着火不可用泡沫灭火器灭火。2.5外伤2.5.1化学灼伤（1）眼睛灼伤化学药品溅入眼内容易造成眼睛灼伤。眼内若溅入任何化学药品，应立即用大量水冲洗15分钟，不可用稀酸或稀碱冲洗。（2）皮肤灼伤①酸灼伤：先用大量水洗，再用稀NaHCO3或稀氨水浸洗，最后再用水洗。②碱灼伤：先用大量水冲洗，再用１％硼酸或２％醋酸浸洗，最后再用水洗。③溴灼伤：这很危险，伤口不易愈合，一旦灼伤，立即用20％硫代硫酸钠冲洗，再用大量水冲洗，包上消毒纱布后就医。2.5.2烫伤使用火焰、蒸汽、红热的玻璃和金属时易发生烫伤，应立即用大量水冲洗和浸泡，若起水泡不可挑破，包上纱布后就医，轻度烫伤可涂抹鱼肝油和烫伤膏等。2.5.3割伤这是生物化学实验室常见的伤害，要特别注意预防，尤其是在向橡皮塞中插入温度计、玻璃管时一定要用水或甘油润滑，用布包住玻璃管轻轻旋入，切不可用力过猛，若发生严重割伤时要立即包扎止血，并迅速到医院就医处置。实验室应准备一个完备的小药箱，专供急救时使用。药箱内备有：医用酒精、红药水、紫药水、止血粉、创口贴、烫伤油膏（或万花油）、鱼肝油、1％硼酸溶液或2％醋酸溶液、1％碳酸氢钠溶液、20％硫代硫酸钠溶液、医用镊子和剪刀、纱布、药棉、棉签、绷带等。2.6生物伤害2.6.1动物伤害动物生物化学实验的一个最大特点就是实验材料均来源于动物组织或细胞，而且，在很多时候要直接使用活体动物进行实验。尽管这些实验材料一般为健康的动物或其组织或细胞，但在进行操作时，应注意以下几点：（1）应穿工作服和戴手套、口罩等进行操作。不得带伤操作，特别是手部有外伤时，以免引起意想不到的后果。（2）在饲养或操作动物时，千万注意不要被动物抓伤或咬伤，造成不必要的伤害。2.6.2微生物伤害在进行动物生物化学实验时，不管实验材料是动物组织或细胞，还是动物本身，抑或直接是微生物，都应注意避免微生物的伤害。实验室内常用的实验动物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、鸡、狗和猪等可能携带有某些人兽共患病病原，一旦被它们抓伤或咬伤，易被感染而患病，轻者造成身体健康的危害，影响生活、工作和学习，重者危及生命。发生这种情况后应立即紧急就医，采取相应的措施进行处置和治疗。2.7仪器设备安全正确使用各种仪器设备，特别是大型和贵重仪器设备，是保证仪器设备安全的根本。有关生物化学实验室常用仪器设备的正确使用方法请参考第3章内容。2.8环境安全严禁将微生物，包括病原性和非病原性微生物以及病原性不清楚者逸出实验室，避免对人和其他动物造成直接或潜在的危险。剧毒性化学试剂，某些有机溶剂，如氯仿、苯酚等不得倒入下水道中。避免对空气、水源和土壤等造成污染和危害。上述种种安全事故，稍一疏忽就可能发生，造成不必要的损失。因此，每一位在生化实验室工作的人员都必须有充分的安全意识，严格的防范措施和丰富实用的防护救治知识，一旦发生意外能够正确地进行处置。