杜塘水库微囊藻的分离培养及生物学特征研究

杜塘水库微囊藻的分离培养研究【摘要】以杜塘水库野生微囊藻为研究对象，利用毛细管法和等比稀释平板法成功的分离出微囊藻单株，初步鉴定为挪氏微囊藻（Microcystisnovacekii），研究表明其生长曲线符合典型的S型单细胞藻类生长曲线，细胞平均生长速率常数k为0.508，细胞平均倍增时间为47h。通过研究不同温度条件对该藻生长的影响表明温度是影响该微囊藻生长的重要因素，在2500lux，光暗比12h：12h时，随着温度的升高，该微囊藻的生长速率逐渐增大。低温（15℃）显著抑制微囊藻的增长，该微囊藻生长的最适温度为25～30℃。【关键词】温度；分离纯化；微囊藻水体富营养化对水资源利用造成了很大危害，如自来水厂滤池的堵塞，藻类死亡产生恶臭，水体DO值下降，以及“水华”毒素引起动物中毒及饮用水安全等问题。因此，研究水体藻类生长的规律及“水华”形成的原因，寻求防治对策，已引起许多学者的重视。杜塘水库位于福建省漳州市云霄县境内，建成于1958年，水库集水区面积约为24.21km2，实际库容为1.27×107m3，水面面积约0.9km2，最大水深约30m，平均水深14m，是东山县及邻近的常山经济开发区等乡镇的主要饮用水源，年供水量约1.255×107m3，供水人口24.1万人。2007年9、10月份，杜塘水库发生大面积水华，水库表层水体呈现浓绿色，局部水面形成粘液状粘稠物质，直接威胁到当地居民的生活饮用水安全，引起了省市有关部门的高度重视。杜塘水库藻类的优势种为微囊藻，其种类达6－7种，本研究对其中常见的一种微囊藻进行分离纯化培养，为研究微囊藻的分离纯化技术及生物学特征研究积累有用的资料。1实验材料与仪器1.1试剂90%丙酮PH7.550mMTris-HCl缓冲液BG11培养液： 成分NaNO3K2HPO4·3H2OMgSO4·7H2OCaCl2·2H2OCitricAcidcombinedwithFerricAmmoniumCitrateEDTANa2CO3TraceMetalsolutionH3BO3MnCl2·H2OZnSO4·7H2ONa2MoO4·2H2OCuSO4·5H2OCo(NO3)2·6H2O含量1.5g/L40mg/L75mg/L36mg/L6mg/L1mg/L20mg/L2.86mg/L1.81mg/L0.222mg/L0.079mg/L0.390mg/L0.0494mg/L1.2仪器海尔HRGZ-300A型光照培养箱HFSAFE-1200型生物安全柜NikonEclipseE200显微镜NikonDigitalsightDS-SMCameraUV-9100紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）L-550台式低速大容量离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）CRDX-280型不锈钢电热手提式灭菌消毒器（上海申安医疗器械厂）1.3试验藻种杜塘水库分离的野生微囊藻2实验方法2.1微囊藻的分离纯化本实验采用毛细管法结合等比稀释平板法对杜塘水库中的微囊藻进行分离纯化。取25号浮游生物网捞取的水库水样，静置，取少量上浮藻类群体样品镜检，确认大部分为微囊藻属种类后，用吸管吸取少许上浮的藻类在200目筛绢上，用无菌水清洗过滤，除去其中混杂的单细胞藻，留下大部分的微囊藻群体，再在显微镜下用毛细管挑取微囊藻群体到无菌的BG11[1]原水混合液中培养（水库原水经过0.45μm滤膜抽滤，高温灭菌处理），作为分离培养的原始藻种。再采用等比稀释平板法：0.9%BG-11琼脂培养基、25℃，2500lux，光暗比12h：12h培养：数天后，挑选表面光滑、蓝绿色、直径约1.5mm的圆形单藻落，放入装有10mL培养液的无菌小三角瓶内培养，生长1~2周后镜检观察。2.2微囊藻的形态特征观察及种的鉴定分离纯化的微囊藻种置于载玻片上观察并拍照，显微观察和拍照采用的设备为NikonEclipseE200型光学显微镜，外接NikonDigitalsightDS-SMCamera，与台式计算机相连拍照，数码拍照和 细胞直径的测量通过其附带的软件NikonElementsF2.20(Build232)控制和实行。软件的图像测量前，用Olympus的物镜测微尺（每小格0.01μm）较正。根据其形态学特征进行种的初步鉴定。2.3微囊藻培养条件及生长曲线的测定　计数不同浓度梯度的微囊藻培养液细胞个数（n）[2]，同时在665nm处测定相应的吸光值，将二者的值做标准曲线。取分离好的微囊藻培养液接入250mL三角瓶，内装100mLBG11培养液，25℃，2500lux，光暗比12h：12h，每日固定时间测定OD665nm值。以天数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制生长曲线。细胞平均生长速率常数公式：k=[3.322/(n-1)]·lg(An/A1)，k为藻细胞平均生长速率常数，n为天数；藻细胞平均倍增时间计算公式：Td=24/k，单位为h。2.4不同温度对微囊藻生长影响的测定实验中设定四个温度梯度，分别是：15、20、25、30℃。实验开始后，每隔一天固定时间测定OD665nm值。以天数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制曲线。一个周期12天。第13天的同一时间测定叶绿素a、类胡萝卜素和藻蓝蛋白的含量。各取5ml藻液离心，沉淀悬浮于一定体积的丙酮(80%)，摇匀，在4℃过夜，悬浮液离心，将上清液用来测定叶绿素a和类胡萝卜素(CAR)。另取5ml藻液离心，沉淀悬浮于50mMTris–HCl缓冲液中(pH7.0)，反复冻熔，获得的悬浮液重新离心，上清液用来测定藻蓝蛋白(PC)。用分光光度计分别测定了663,480和610nm的吸光度来求得chla,CARandPC,分别用公式CChla=13.9*OD663、CCAR=OD480/200、CPC=OD610/7.5[3]来定量光合色素。最后以温度为横坐标，色素含量为纵坐标绘制柱形图。3实验结果3.1微囊藻的分离纯化本研究通过毛细管法和等比稀释平板法挑取藻落培养，对培养成功的藻液进行显微镜观察，确认为微囊藻单种，分离成功的微囊藻藻种即为下面实验提供材料。3.2微囊藻的形态特征及种的鉴定在显微镜下观察，待分离的微囊藻群体直径约为50-100μm，群体通过胶被连接堆积成更大的球体或不规则的群体，胶被无色，边界模糊、无折光。胶被不密贴细胞，细胞排列不十分紧密，细胞直径约5μm，细胞原生质体黄绿色，有气囊，与虞功亮等（2007）描述的挪氏微囊藻特征相符，故初步鉴定其为挪氏微囊藻，名称为M.novacekiistrainDutang。分离后的微囊藻在实验室培养五个月后仍未完全单细胞化，细胞个体较分离前大，但仍有少量以群体形式存在，群体球形或不规则形状，胶被边缘不明显、无色、无折光，胶被内细胞排列较分离前的种稀疏，细胞多成对出现，细胞球形，群体内细胞直径5-8μm，单细胞个体较大，直径平均为8μm（图1） 注.左图为挪氏微囊藻杜塘株的液体培养照片，右图中1bar为20μm图1挪氏微囊藻杜塘株照片Fig1PhotosofM.novacekiistrainDutang3.3标准曲线及生长曲线如图2细胞密度与OD665呈直线关系，R2=0.9915。故可以通过测定藻溶液的光密度值来代表微囊藻的生长情况，通过比较光密度值，分析不同环境因子对微囊藻生长的影响。图2微囊藻细胞密度与吸光值相关性标准曲线Fig2CalibrationcurveoftheconcentrationversusabsorptionforM.novacekiistrainDutangat665nm图3显示了微囊藻在接种初始浓度OD665为0.037、培养条件为25℃，光照强度为2500lux，光暗比12h：12h的生长曲线，由图中可以看出，此种微囊藻的生长曲线符合典型的S型曲线，在生长期前5天，增长较为缓慢，为生长延滞期，第5天后，进入对数生长期，在第6天达到最大日增长速率为0.5，对数生长期持续到第13天，此后进入衰亡期。通过公式计算得出细胞平均生长速率常数k为0.508，细胞平均倍增时间为47h。 图3挪氏微囊藻杜塘株生长曲线Fig3GrowthcurveofM.novacekiistrainDutang3.4不同培养温度的影响对于多数藻类来说，温度是重要的环境因子，尤其是狭温性的种类，温度往往成为其限制性因子。在本实验中，所设的温度梯度为15、20、25、30℃。从生长曲线图（图4）可以看出，微囊藻在15℃条件下，几乎不生长。在20、25、30℃条件下，微囊藻的生长速率随着温度的升高而增大，但是到了后期、本实验第七天后，微囊藻在30℃的生长速度变缓，而25℃组的微囊藻继续保持快速生长。从比生长速率的比较（图5）来看，微囊藻在25℃时生长最快，30℃条件下的比增长速率明显高于20℃条件。经显著性检验发现（表1），不同温度水平之间，尤其是在低温与中高温之间的效应存在显著差异。图4不同温度对挪氏微囊藻杜塘株生长的影响Fig4EffectsofdifferenttemperatureongrowthofM.novacekiistrainDutang 图5不同温度对挪氏微囊藻杜塘株比生长速率的影响Fig.5TherelativegrowratesofM.novacekiistrainDutangunderdifferenttemperature表1低温和中高温对挪氏微囊藻杜塘株生长影响的方差分析表Table1LowtemperatureandhightemperaturegrowthofM.novacekiistrainDutanganalysisofvariancetable差异来源平方和自由度均方FF0.05F0.01显著性处理间0.03220.4164.4163.6826.359*图6显示了不同温度下微囊藻的主要色素的含量，结果表明，在15-25℃范围内，温度的升高有利于微囊藻叶绿素a[4]和类胡萝卜素的累积，藻蓝蛋白的含量在30℃条件下却小于25℃，这也解释了微囊藻在实验后期，30℃条件下，生长速率小于25℃对照组的现象。由此可以推断，微囊藻的最适生长温度在25℃-30℃[5]。A.叶绿素a和类胡萝卜素含量变化(Chlorophylla&carotenoidcontent) B.藻蓝蛋白含量变化（Phycocyanincontent）图6不同温度下挪氏微囊藻杜塘株色素的含量Fig.6EffectofdifferenttemperatureonpigmentcontentofM.novacekiistrainDutang4讨论近几十年，研究者利用各种方法从野生微囊藻中分离单株，1989年MakotoShirai成功地用固体培养基分离得到了微囊藻的纯藻株[6]，本实验中用毛细管结合等比稀释平板法成功地分离到单株微囊藻。国内微囊藻研究初期主要集中在种类鉴定和毒理分析方面。如李仁辉等进行了绿色微囊藻的种类鉴定[7]，何家苑等研究了铜绿微囊藻和惠氏微囊藻的毒性[8,9]等。不少研究者都发现,蓝藻在温度条件不利时会进入休眠状态,直至环境条件适宜时开始生长,从而出现“休眠-复苏”现象[10,11,12],微囊藻在15℃时生长开始加速并且迁移至水体中。李阔宇等[13]的研究结果表明,底泥中微囊藻的复苏在15℃下开始启动。Tsujimura等[14]研究了日本琵琶湖中微囊藻群体的季节性变化,发现大部分微囊藻的浮力在6月份变化比较大,这时的水温一般超过20℃。孔繁翔等[15]将蓝藻水华的形成分成相互区别而又连续的4个过程:下沉和越冬(休眠),复苏,生物量增加,聚集上浮形成水华,并认为温度在休眠和复苏过程中占有重要的作用。温度对藻类生长周期的影响，主要是对藻类生理活性的影响，藻类生理活动所需的酶，在适宜的温度范围内，随着温度的升高其活性增加，藻类的代谢速率加快。研究表明，藻类代谢活动强度与温度的关系符合一般生理学规律：在其它环境条件适合的情况下，在一定范围内，温度每升高10度，藻类代谢活动增加2倍。当温度升高，氮、磷等营养物质在水体中的迁移转化过程加速，同时由于水中溶解氧含量减少，藻类呼吸量增大，从而有利于藻类对营养物质的吸收，促进各种生物化学反应的进行，以满足藻细胞完成自身生长、繁殖的需要，因此，温度为25℃-30℃时，藻类适应新环境的能力较强，其生长过程的迟缓期时间较短，能较快地进入代谢活动强度相对较强的对数生长期，表现为藻类的比增长率相对20℃增大。但是由于温度升高，藻类对营养物质的吸收，藻类细胞活性增强，代谢速率加快，所需消耗的营养物质增多，使得水体中可利用的营养物质减少，导致高温下藻类细胞死亡率大于增值率，藻类生长的稳定期时间大大缩短，迅速进入衰亡期阶段。低温（15℃）时不利于微囊藻的生长，因为低温抑制微囊藻细胞的生理活性，另外在低温环境中，微囊藻细胞的运动能力下降，易于沉降，不利于接受光照和吸收营养，从而影响了微囊藻细胞的生长增值。因此，温度不仅影响藻类细胞的生理生化反应，同时也对藻类细胞吸收利用水体中营养物质的程度产生影响，这两种方式是并存的，属于共同作用又相互竞争的关系。不同温度下色素的含量与藻类的比增长率的变化保持一致，因为当藻细胞数增多时，其细胞内所含有的叶绿素a和类胡萝卜素也会相应的升高。5小结 （1）利用毛细管法和等比稀释平板法能够成功的挑取微囊藻单株。（2）本实验条件下，挪氏微囊藻细胞增长值达到最大时的条件是：温度25℃-30℃，光照2500lux，光暗比12h：12h。其生长曲线呈现典型的“S”型，可以划分为四个阶段：迟缓期；对数生长期；稳定期；衰亡期。（3）温度对微囊藻的生长具有显著意义。高温（30℃）有利于微囊藻的生长繁殖，低温（15℃）时微囊藻几乎不能生长，处于休眠状态，而中温对微囊藻的生长繁殖最为有利。因此，不同温度水平之间，尤其是在低温与中高温之间的效应存在显著差异。叶绿素a、类胡萝卜素和藻蓝蛋白含量与微囊藻细胞的比增长率变化保持一致。参考文献[1]PetersonRB.EffectsofO2andCO2concentrationsonQuantumyieldsofphotosystemsⅠandⅡintobaccoleaftissue[J].PlantPhysio,1991,97:1388-1394.[2]许江映.小学环境教育模式的构建和实践[J].环境教育,2003,41：36．[3]LeseerPacker，AlexanderN．Glazer，MethodsinEnzymologyl[M].NewYork:AcademicPress.1988,167.[4]国家环境保护总局．水和废水监测分析方法[M]．第4版．北京:中国环境科学出版社,2002,670-671．[5]WuHY,SuJ,ShiW.StudyongrowthandtoxinproductionofMicrocystisaeraginosastrainunderdifferentconditions.JournalofEnvironmentandHealth[J].2006,23(4):304～307(吴和岩,苏瑾,施玮.铜绿微囊藻的生长及产毒条件研究.环境与健康杂志[J],2006,23(4):304～307).[6]MakotoShirai,etal.DevelopmentofasoildmediumforgrowthandisolationofaxenicMicrocystisstrains(Cyanobacteria).AppEnuiroMicrobiology[J],1989,10:2569-2571.[7]李仁辉等.中国新记录蓝藻-绿色微囊藻及其毒性的初步研究.水生生物学报，1993,17（3）：282-284.[8]何家苑等.东湖铜绿微囊藻的分离与鉴定.海洋与湖沼,1988,19（5）：424-430.[9]何家苑等.我国产毒微囊藻的新发现—惠氏微囊藻及其毒性的初步研究.水生生物学报，1996，20（2）:192-195.[10]BarbieroRP,KannJ.1994.TheimportanceofbenthicrecruitmenttothepopulationdevelopmentofAphanizomenonflos2aquaeandinternalloadinginashallowlake[J].JournalofPlanktonResearch,16:1581-1588.[11]HanssonLA.1996.Algalrecruitmentfromlakesedimentsinrelationtograzing,sinkinganddominancepatternsinthephytoplanktoncommunity[J].LimnolOceanogr,41:1312—1323.[12]ReynoldCS.1973.GrowthandbuoyancyofMicrocystisaeruginosaKtz.Emend.Elenkininashalloweutrophiclake[J].ProceedingsoftheRoyalSocietyB:BiologicalSciences,184:29—50.[13]李阔宇,宋立荣,万能.底泥中微囊藻复苏和生长特征的研究[J].水生生物学报,2004,28(2):113—118.[14]TsujimuraS,TsukadaH,NakaharaH,etal.2000.SeasonalvariationsofMicrocystispopulationsinsedimentsofLakeBiwa,Japan[J].Hydrobiologia,434:183—192.[15]孔繁翔,高光.大型浅水富营养化湖泊中蓝藻水华形成机理的思考[J].生态学报,2005,25(3):589—595.TheStudyofIsolationandCultureofAlgaeinDutang ReservoirCollegeoflifesciencesFujianNormalUniversityMajor：BiologicalSciences108012005027Xiao-juanLiuSupervisor:YiZhengAbstractAwildalgalstrainfromDutangreservoirwassuccessfullyisolatedthroughCapillarymethodandGeometricdilutionplatemethodandidentifiedasMicrocystisnovacekii.ResultsofcultureshowedthatitsgrowthcurveinlinewiththetypicalS-typeofgrowthcurveofunicellularalgae.Therelativecellgrowthrateskis0.508andtheaveragedoublingtimeis47h.Thetestfortheinfluenceofdifferenttemperatureonthegrowthofalgaeshowedthattemperatureplayedanimportantroleinthealgalgrowth.Whentheexperimentalconditionsweresetas2500luxinlightintensityand12h/12hinlight-darkcycle,thegrowthrateofalgaeincreasedastemperaturewentup.Thealgalgrowthwasinhibitedunderlowtemperature(15℃)andtheoptimalgrowthtemperatureis25~30℃.Keywordstemperature;purification;Microcystis