生物安全管理体系文件

生物安全管理体系文件实验室生物安全管理制度目的：确保实验人员生物安全，环境不受污染，样品质量不受影响特制定该管理制度。一、人员准入条件1、实验室人员、辅助人员和外来人员必须具备相应的专业技能、受过相关的实验室生物安全培训、了解实验室潜在的生物危害和特殊要求，经负责人审批后方可进入相应的实验室工作。2、未成年人、孕妇和有免疫缺陷的人员不得进入实验室，处于易受感染状态或感染后果严重的额人员也不得进入实验室。3、实验室人员必须在身体状况良好、穿戴好防护服（白大衣）的情况下，方能进入实验室的污染区域工作。但当身体出现较大的开放性损伤、处于较重的疾病感染状态或呈重度疲劳状态时不得进入。4、外来参观人员需经科室负责人同意并在相关人员陪同下方可进入实验室。二、生物安全日常管理：(一)生物安全行为规范1．进入实验室前要摘除首饰，修剪指甲，以免刺破手套。长发应束在脑后，禁止在实验室内穿露脚趾的鞋。不得佩戴有可能被卷入机器或可随人传染性物质的饰物。2．在实验室里工作时，要始终穿着实验服，实验室外禁止穿防护服 （白大衣）。大白衣应定期清洗、更换，清洗时应使用具有杀菌消毒的洗液或其他相应方法。3、操作感染性物质、腐蚀性或毒性物质时须在通风橱中进行，并佩戴相关的安全防护用品，如安全镜、面罩或护目镜。皮肤受损时应以防水敷料覆盖。4、当有必要保护眼睛和面部以防实验对象喷溅、或紫外线辐射时，必须要配戴护目镜，面罩（带护目镜的面罩）或其它防护用品。5、实验室工作区不允许吃、喝、化妆和操作隐形眼镜，禁止在实验室工作区内的任何地方贮存人用食品及饮料。6、实验室防护服不应和日常服饰放在同一柜子。个人物品、服装和化妆品不应放在有规定禁放的和可能发生污染的区域。7、不得涉及呼吸道传播疾病样品室，要佩戴符合要求的防护口罩。(二)操作准则1、所有样本、培养物均可能有传染性，操作时均应带手套。在认为手套已被污染时应脱掉手套，马上洗净双手，再换一双新手套。2、当实验过程可能涉及到直接或意外接触到血液、有传染性的材料或被感染的动物时，必须要戴上合适的手套，脱手套后必须洗手。在实际或可能接触了血液、体液或其他污染材料后，即使戴有手套也应立即洗手。3、不得用戴手套的手触摸自己的眼、鼻子或其他暴露的黏膜或皮肤。不得带手套离开实验室或在实验室来回走动。4、严格禁止用嘴操作实验器材，包括吸液、吹酒精灯等。实验材料禁止放入嘴里。禁止舔标签。 5、尽量用塑料制品代替玻璃制品，不使用破裂或有缺口的玻璃器具。破损的玻璃不能直接用手直接操作，必须用机械方法清除，如刷子、夹子、镊子等。破裂的玻璃器具和比例碎片应丢弃在有专门标记的、单独的，不易刺破的容器里。6、所有的实验步骤都应尽可能使气溶胶或气雾的形成控制在最小程度。任何使形成气溶胶的危险性上升的操作都必须在生物安全柜里进行。有害气溶胶不得直接排放。7、应尽可能减少使用利器和尽量使用替代品。包括针头、玻璃、一次性手术刀在内的利器，应在使用后立即放在耐扎容器中。尖利物容器应在内容物达到三分之二前置换。8、所有溅出事件、意外事故和明显或潜在的暴露于感染性材料，都必须向实验室负责人报告。此类事故的书面材料应存档。9、所有弃置的实验室生物样本、培养物和被污染的废弃物应被假定有传染性，在从实验室中取走之前，应以安全方式处理和处置，使其达到生物学安全。10、实验室应保持整洁、干净，当潜在的危险物溅出或一天的工作结束后，所有操作台面、离心机、加样枪、试管架必须擦拭、消毒。11、每日工作完毕，最后一个离开实验室的人员需关好水、电、门、窗。(三)监督与检查1、涉及病原体的科室负责人要经常对各项实验的生物安全性进行检查和监督。2、各实验项目主管人员要定期对所开展的实验工作进行监督与检查，及时发现并报告安全隐患事件。三、常见实验室废弃品处理 实验室废弃品按物理类型而言可分为固体废弃品、液体废弃品及气体废弃品，就危害类型而验分为化学毒性废品和病原性废品，由于废弃物品具有潜在的致病性、伤害性，如不妥善处理会造成很大的人身危害、环境污染和社会危害。根据《国家危险废物品名录》、《医疗废物管理条例》、卫生部和国家环境保护总局制定的《医疗废物分类目录》有关规定的要求，对实验室废弃物进行分类，主要包括感染性废弃物、病理性废弃物、损伤性废弃物、化学性和放射性废弃物等。四、支持文件1.《中华人民共和国传染病防治法》2.《病原微生物实验室生物安全管理条例》3.《实验室生物安全通用要求》(改变9489-2004)4.《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233-2003）5.《实验室生物安全守则》（WHO,第三版，2004年）6.《病原微生物实验室生物安全》（生物安全培训卫生部规划教材，第2版）7.《医疗废弃物管理条例》8.《实验室生物安全》病毒制备质量管理体系目录原始病毒的扩增大量病毒制备的灭菌操作病毒制备程序痘苗病毒的收获和纯化腺病毒的收获和纯化 病毒滴度测定病毒质控细菌污染及检测支原体污染及检测基因检测病毒活性检测体外细胞杀伤复制能力检测原始病毒的扩增---病毒种子制备一般原始病毒的扩增用优质（无污染-须通过细菌和支原体检测）CV1/JH293细胞，每种原始病毒的扩增需要在一个细胞融合度≧80%（细胞处于对数生长期，活性好，感染效率高）的T175培养瓶中进行：1.细胞计数：①培养箱中取出细胞，镜下观察，将状态良好，融合度≧80%的细胞移至超净工作台。②去除细胞培养瓶中的旧培养基。③PBS冲洗：从无细胞一侧加入适量（约10ml）PBS冲洗细胞后弃上清，酌情反复1~2次，以达到彻底洗掉培养基中的血清成份。④消化细胞：加入1ml0.25%胰酶消化液，使之铺满细胞表面，放入培养箱（37 ℃）作用数分钟后，把培养瓶放置显微镜下观察，发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大；或肉眼观察，见到瓶底出现细针孔间隙倾斜瓶子出现流沙样现象即可终止消化。⑤终止消化：轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，从无细胞面侧加入适量完全培养基（含血清的DMEM）终止消化，并用移液管吸吹数次以打散细胞团块，混合均匀，使之成为单细胞混合液。⑥计数板准备：用酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干。⑦加样：用移液管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液（可酌情稀释），在计数板上盖玻片一侧靠虹吸现象加入微量（约10ul）细胞悬液，使之充满玻璃槽，不可产生气泡，不可溢出外侧亦不可溢入对侧玻璃槽。如产生上述情况需对计数板冲洗拭干重新加样。⑧计数：静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移，将细胞计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于活细胞的遮光率和液体的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。⑨计数时计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。按下式计算：细胞悬液细胞数/ml＝4个大格细胞总数/4×10000×稀释倍数2.感染种子：取平行对照培养优质融合度≧80% 的细胞，弃旧培养基并加入含病毒种子的30mL感染培养基（DMEM+10%FBS+1pfu/cell），轻轻晃动培养瓶，使病毒在培养基中充分混匀。3.收集种子：标记病毒种类和培养日期，在37oC，5%CO2条件下培养。定时（24h/48h/60h/72h)检查CPE(细胞变圆变亮脱壁，漂浮)，待≧80%细胞出现CPE，即可收集。将含病毒细胞悬液加入50mL离心管中，标记病毒种类和日期，冻存于-80℃备用，并测定病毒滴度，以备感染病毒使用。大量病毒制备的灭菌准备工作1.用过的500mL离心瓶泡入酸液中，过夜，冲洗干净，烤干，高温灭菌。2.准备足量T175培养瓶必须泡入酸液中，过夜，用水充分冲洗，干燥，灭菌包布包被灭菌。3.培养细胞所用的移液管，离心管必须泡入酸液中，过夜，用冲洗干净，干燥，灭菌包布包被灭菌。4.离心管泡入酸液中，过夜后再处理，针头直接灭菌，在移除针头钱，确保离心管实在一个大烧杯上，这样漏液不会污染操作台。5.研磨器泡入酸液中，过夜，用水充分冲洗，干燥，灭菌包布包被灭菌。6.Beckman超高速离心机及特制转子和离心管准备。7.V型槽，96孔板，排枪准备。病毒制备程序一．细胞准备：1.建立细胞种子库：复苏细胞（CV1用于痘苗病毒病毒；JH293 用于腺病毒病毒）分别于与第3/5/7/14天取上清两份，一份用于支原体检测，另一份加至培养基中放于培养箱中定时镜下观测，用于细菌检测，保证细胞质量。待细胞生长细胞融合度≧80%消化传代扩增并冻存足量细胞种子于液氮中，冻存管上须准确标记所冻细胞名字，代数，冻存人以及冻存日期等相关信息。（慢冻速溶）2.细胞扩增培养：①当1瓶T175培养瓶中细胞生长融合度≧80%时，将培养瓶中培养基吸出，各加入1ml胰酶消化，37℃，2-3分钟；加入适量（5ml）完全培养基终止消化，全部转移至50ML离心管中，总量为6ml。分别抽取2ml此混合液加入含18ml完全培养基（含10%血清）的T175培养瓶中共三瓶继续培养（1传3），原瓶继续培养待下一次传代。②继而同上方法扩增至12瓶T175培养瓶培养（1传4）细胞生长融合度≧80%时同上方法扩增至36瓶为一批（1传3），其中1瓶T175培养瓶中细胞作为平行对照，放入37℃CO2孵育箱中培养48-72小时。平行对照培养瓶同时放入孵育箱，直至融合度≧80%。二．病毒感染：①观察平行对照培养瓶中细胞生长率≧80%时，准备进行病毒感染；同时也观察其它所有细胞，对比细胞增殖速度是否一致。②取平行对照瓶细胞计数，并计算需要感染病毒量（1pfu/cell)。③-80℃冰箱中取出测定过病毒滴度的病毒种子，按计算好的病毒量配制1080ml（30ml/瓶×36瓶）含2%血清的DMEM培养基。放入37℃二氧化碳孵育箱中培养48-72小时，或直到≥90%细胞都出现CPE。 痘苗病毒的收获和纯化三．病毒收获：1)从37℃二氧化碳孵育箱中取出达到收获标准的36瓶T175培养瓶，轻轻晃动培养瓶，少量贴壁细胞即刻脱落。而后移至超净工作台用移液管轻轻吹打未脱落细胞，并将含病毒混合液分装（收集）到灭菌的500ml离心瓶中。2)移至高速离心机中配平，3500rpm，15min，4℃离心。3)弃上清，移液管取10ml冷PBS加至离心瓶中重悬混匀，将液体转入50ml离心管中。4)方法同上，用冷PBS反复清洗两次500ml离心瓶，并将液体转致同一50ml离心管中。5)移至高速离心机中配平，3500rpm，15min，4℃离心。6)弃上清，4℃取7ml冷VV-Buffer重悬混匀，并冻存于-80℃待纯化。四．病毒纯化：1)将待纯化病毒溶液在液氮与37℃水浴锅中反复冻融三次，使包含于细胞内的病毒颗粒完全释放。2)将完全融化的病毒液移至超净工作台，加入灭菌的研磨器中匀速缓慢反复研磨60次。3)将研磨好的病毒液转入50ml离心管中配平，1200rpm，5min，4 ℃离心。4)吸取上清于另一50ml离心管中，取3mlVV-Buffer重悬沉淀，2mlVV-Buffer冲洗离心管，加至同一50ml离心管，将混合液再次加入研磨器中反复研磨60次。5)将研磨好的病毒液转入50ml离心管中配平，1200rpm，5min，4℃离心。6)取上清于一新的无菌离心管中，移至超声仪中超声（破碎）两次，每次20s。7)在SW41Beckman离心机专用离心管中加入7ml36%蔗糖（w/v)〖10MMTris-Hcl（PH9.0）配制〗，再沿管壁缓慢加入3.5ml研磨超声处理过的病毒液，使之形成分层。8)用VV-Buffer称重配平，误差须小于0.5g（误差越小越好），移至Beckman离心机中（1~4/2~5/3~6转子对应配平）13500rpm/32900xg，80min，4℃。9)待离心结束，将转子移至超静工作台打开，用镊子小心拿掉转子盖子，切勿污染，再用无菌镊小心取出离心管，去除上清，取6mlVV-Buffer重悬沉淀。10)梯度蔗糖：底层为4ml40%蔗糖溶液(用10mMTris-HCLpH9.0配制) ，依次向上分别为4ml35%蔗糖溶液；4ml30%蔗糖溶液和4ml25%蔗糖溶液（最上层）。每个病毒样本制备至少两份梯度，分别小心在上层加入病毒悬液，使之形成分层。11)用10mMTris-Hcl（PH9.0）称重配平，误差须小于0.5g（误差越小越好），移至Beckman离心机中（1~4/2~5/3~6转子对应配平）20000rpm，60min，4℃。12)待离心结束，将转子移至超静工作台打开，用镊子小心拿掉转子盖子，切勿污染，再用无菌镊小心取出离心管，去除上清，取2mlVV-Buffer重悬沉淀。13)病毒分装与储存：取灭菌EP管，取少量病毒液进行滴度测定，其余根据实验需要按20ul/50ul/100ul/支并按规定明确标记病毒名称，日期等信息后，冰上分装冻存于-80℃冰箱病毒库。腺病毒的收获和纯化三.病毒收获：7)从37℃二氧化碳孵育箱中取出达到收获标准的36瓶T175培养瓶，轻轻晃动培养瓶，少量贴壁细胞即刻脱落。而后移至超净工作台用移液管轻轻吹打未脱落细胞，并将含病毒混合液分装（收集）到灭菌的500ml离心瓶中。 8)移至高速离心机中，2000rpm，10min，4℃离心。9)弃上清，移液管取10ml冷PBS加至离心瓶中重悬混匀，将液体转入50ml离心管中。10)方法同上，分别用冷PBS5ml反复清洗两次500ml离心瓶，并将液体转致同一50ml离心管中。11)移至高速离心机中配平，1000rpm，10min，4℃离心。12)弃上清，4℃取12ml冷的10mMTris.HCI(Ph8.0)重悬混匀，并冻存于-80℃待纯化。四．病毒纯化：1.将制备的含病毒溶液在液氮和37℃水浴中反复冻融三次。2.将该溶液37℃水浴融化，转入50ml离心管中，室温，6000rpm离心10分钟。保留上清，冻存于-80℃冰箱或立即进行CsCI梯度离心。3.将6只超高速离心用离心管中分别先加入10ml1.25g/mlCsCI.再小心轻轻加入7.6ml1.4g/mlCsCL,然后将病毒混合液平均轻轻加入CsCI液面上。4.称重，用灭菌的Tris.HCI(Ph8.0)配平，误差＜0.1g。5.将离心管放入BeckmanSW32转子中，放入LE-80K超速离心机中（1~4/2~5/3~6转子对应配平）离心，25000rpm，15℃，2小时。6.小心取出离心管放于无菌操作台中，将离心管夹于管夹上，用19 号针头刺入离心管，小心抽取夹层膜状物（病毒条带呈乳白色），尽量多抽，将所抽出液体转入50ml离心管中。7.将50ml离心管中含病毒液体顺液面轻轻平均分配加入至已加入3ML1.35g/mlCsCI溶液的5ml超高速离心用离心管中。8.用Tris.HCI(Ph8.0)称重配平，误差＜0.1g。9.将离心管放入BeckmanSW41转子中，放入LE-80K超速离心机中（1~4/2~5/3~6转子对应配平）离心，40000rpm，15℃，15小时。10.小心取出离心管放于无菌操作台中，将离心管夹于管夹上，用19号针头刺入离心管，小心抽取夹层膜状物（病毒条带），尽量少抽，将所抽出液体转入50ml离心管中。11.将液体注入透析袋中，放入透析液中，于冷室中透析24小时。12.病毒分装与储存：透析结束后，将透析袋转至无菌工作台中，取少量病毒液进行滴度测定，其余病毒液根据实验需要按20ul/50ul/100ul/支并按规定明确标记病毒名称，日期等信息后，冰上分装储存于-80℃冰箱病毒库。病毒滴度测定（TCID50）1．培养CV-1（VV）或JH293（AD）细胞。2．当培养瓶中细胞生长率≧80%时，将各培养瓶中培养基吸出，各加入少量胰酶消化，37℃，2-3分钟；再各加入5mL10%FBS的DMEM培养基混匀，细胞计数。3．根据细胞计数结果将细胞铺入96孔板，每孔3×103细胞于200微升10%FBS的DMEM，过夜。4．第二天早晨，按比例稀释病毒，一般是1：105稀释： 第一排用排枪加入20微升，轻轻混匀5次，去掉枪头；从第一排吸取22微升加入到的第二排，轻轻混匀5次;同样从第二排吸取22微升加入到第三排，轻轻混匀5次；依次到倒数第二排，最后一排做对照。5.从感染病毒起，第8~10天观察。先观察最后一排细胞状态，长满时，计每排CPE的数值。计算病毒滴度。6.代入以下表格计算病毒滴度：病毒质控一、细菌污染及检测；二、支原体污染及检测；三、基因检测；四、病毒活性检测；五、体外细胞杀伤复制能力检测。一、细菌污染及检测：1.1背景介绍：细菌是一种元和细胞微生物，其大小以微米计。常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄菌等比较常见。纯化后的病毒有细菌污染时并不容易发现。所以，做病毒的细菌质控非常必要。1.2实验步骤：当做细菌检测时，可以取10ul已经纯化好的病毒加入无抗生素4ml的培养基（目前实验室所用的是LB培养基）试管中，将试管置于37℃，1800rpm的摇床上摇过夜（12-16h）,如果有细菌污染，16h内就可获得阳性结果。 1.3结果判读：多数情况下当受到细菌污染时，培养基短时间内颜色变黄，产生大量酸性物质，出现明显混浊现象，此时的培养基稍加振荡就会有混浊物悬起。在倒置显微镜下观察，可见培养基有大量圆球状颗粒漂浮，此种情况即可判定为阳性，病毒受到细菌污染。若无，则判读为阴性。二、支原体污染及检测：2.1背景介绍：支原体是一种介于细胞和病毒之间、能独立生活的最小微生物，最小的直径0.2um,约有1%可通过滤菌器，无细胞壁，形态呈多形性，可为圆形、丝状或梨形。在光镜下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构，其中央有电子密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体的污染是一个常见又棘手的问题。支原体污染后，因它可与病毒长期共存，培养基一般不发生混浊，外观上往往给人以“正常”的感觉，实则可能对后期实验产生潜在影响，所以对支原体的污染必须严加防范。支原体污染常用检测方法有相差显微镜法、DNA荧光处理法、电镜检测法、低张处理地衣红染色观察、支原体PCR检测法等。实验室目前使用的是PCR检测法。2.2实验步骤：（1）实验前准备：①样本和对照准备：样本：收集待检测病毒样本，若为病毒原液则可用5ul原液加495ul 细胞培养基（确定无污染）进行100倍稀释。阳性对照：从医院取得支原体阳性样本，高压灭菌后（可分装50ul一支）做阳性对照。阴性对照：灭菌蒸馏水。②引物的准备：Fwd-1.：ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAFwd-2.：CCTAAAGGAATTGACGGGAACCCGRev.：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC以上引物可以检测出常见的14种不同支原体。按要求稀释为50pmol/ul，分装为50ul/管，﹣20℃保存，待使用。（2）PCR反应：配置全过程需在冰上操作：①1stRound–bandat720bp按下列组分配置PCR反应液：10*PCRBuffer2ulDntp(2.5mM)MgCl2(25mM)Fwd-1.Rev.Taq酶95℃x30s95℃x30s56℃x30s72℃x1min1.6ul1.2ul1ul1ul0.3ul35cyclesMIX反应大约需1.5小时，由此得到第一轮相应的PCR产物，在打开PCR管前先离心甩一下，接着进行第二轮145bp的PCR鉴定。 ②2ndRound–Bandat145bp按下列组分配置PCR反应液：10*PCRBufferDntp(2.5mM)MgCl2(25mM)Fwd-2.Rev.Taq酶2ul1.6ul1.2ul1ul1ul0.3ulMIX加过模板，第一轮产物可加1ul10*lodingbuffer,混匀后先放置4℃冰箱。待跑琼脂电泳胶。nd95℃x30s95℃x30s56℃x30s72℃x1min35cycles第二轮产物加1ul10*lodingbuffer，终止反应，跑琼脂电泳胶。（3）琼脂电泳跑胶：①配置1%的琼脂糖凝胶即可。首先将锥形瓶洗干净，然后根据样本量和胶的大小取一定量的电泳缓冲液（1×TAE）至锥形瓶中，再称取相应量的AGAROSE（琼脂糖）倒入锥形瓶中，摇匀，最后放入微波炉加热，煮胶的过程中需注意安全，应适当摇匀，防止爆沸。煮好的凝胶需无气泡、色泽及质地均匀。将煮好的凝胶放入均匀冷却至50℃左右时，加入相应EB,混匀，及时将凝胶倒入装好的干净模具中。待凝胶完全凝固（约30min ）后，垂直方向拔梳子。此时，凝胶需平整、不漏孔，可以用于电泳检测。②胶前准备：先将干净的电泳槽排放整齐并做好标记，然后把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央。胶孔的方向朝向负极（注意：①放凝胶前，需将胶托底部的凝胶抹干净，防止胶托在电泳槽中滑动；②此时，可顺便观察凝胶是否漏孔）。再往电泳槽中倒入一定量的电泳缓冲液（1×TAE）至刚好将凝胶淹没。（注意保持桌面卫生，防止缓冲液洒到桌。③上样：将两轮的产物和lodingbuffe混合后，轻甩，按照规定的顺序上样，上样顺序应与电泳槽上的标记一致。注意:上样时必须确保上样顺序正确无误，样品间不混淆，点样后的空管子先放在电泳槽旁边，用于核查；点样时不戳孔、不外漏、不溢出；点样时需小心枪头不要碰到凝胶，以免凝胶挪动，若凝胶已经挪动，需等样品完全沉到底部后，再固定凝胶.样品上完后，加阳性对照，阴性对照。每排胶上留一孔加Maker(D2000bp),5ul.④跑电泳：确认已经正确上样后，双手同时盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽（注意：确认电极正确连接），设置电泳参数：电压：100V，电流： 400mA，时间：25min；注意确认电极、电泳参数完全正确之后，最后按star键开始电泳。⑤凝胶成像：带上PE手套，将凝胶从染胶盘中捞出，放在染胶时的那个PE手套上（注意：捞胶时需小心防止凝胶断裂、滑落，尽量把多余的EB染液甩干），将凝胶放入凝胶成像系统中，按照“Tanon凝胶成像系统操作规程”进行操作拍照。（注意：拍照时需严格区分EB污染区与非污染区，防止EB污染区污染电脑、键盘及鼠标），最后保存胶图信息至规定的文件夹内，命名规则为：日期+姓名+工号+部门+电泳铜人阵考核。注意事项1、电泳中使用的溴化乙锭（EB）为中度毒性、强致癌性物质，务必小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。操作时戴上乳胶手套，必要时戴上PE手套和口罩。三．基因检测：试验1：BioTTT001基因组测序试验一、目的检测BioTTT001序列信息二、试剂来源、配制及保存条件三、仪器设备四、试验过程1.病毒基因组提取1.1向200ulBioTTT001原液中加入10ul蛋白酶K，混匀。1.2加入200ulALBuffer，震荡15s混匀；轻微离心后，放入56 度水浴锅内，孵育10分钟。1.3加入200ul无水乙醇，震荡15s混匀；轻微离心后，转移样品到新吸附柱中。1.4离心8000转1分钟，转移吸附柱到新2ml离心管中。1.5加入500ulBufferAW1，离心8000转1分钟。1.6弃废液，向吸附柱中加入500ulBufferAW2，14000转离心3分钟。1.7弃废液，空转1分钟；将吸附柱转移到新的1.5ml离心管中。1.8向吸附柱中加入50ul超纯水，室温静置1分钟，14000转离心1分钟2.浓度测定2.1吸取2ul超纯水，滴到样品检测孔处，进行校准。2.2抬起测量臂，擦拭残留液体。2.3吸取1ul待检测样品，滴加到样品检测处，放下测量臂，记录数据。3.送华大基因测序3.1准备总量为2.5ug，浓度不低于80ng/ul的样品，进行测序。3.2华大基因进行样品检测，并出示检测报告。3.3样品检测合格后，建立样品库进行测序。3.4数据分析。试验2：BioTTT001基因组酶切试验SOP一、目的通过酶切验证BioTTT001的构建 二、试剂来源、配制及保存条件三、仪器设备四、试验过程1.病毒基因组提取1.1向200ulBioTTT001原液中加入10ul蛋白酶K，混匀。1.2加入200ulALBuffer，震荡15s混匀；轻微离心后，放入56度水浴锅内，孵育10分钟。1.3加入200ul无水乙醇，震荡15s混匀；轻微离心后，转移样品到新吸附柱中。1.4离心8000转1分钟，转移吸附柱到新2ml离心管中。1.5加入500ulBufferAW1，离心8000转1分钟。1.6弃废液，向吸附柱中加入500ulBufferAW2，14000转离心3分钟。1.7弃废液，空转1分钟；将吸附柱转移到新的1.5ml离心管中。1.8向吸附柱中加入50ul超纯水，室温静置1分钟，14000转离心1分钟2.浓度测定2.1吸取2ul超纯水，滴到样品检测孔处，进行校准。2.2抬起测量臂，擦拭残留液体。2.3吸取1ul待检测样品，滴加到样品检测处，放下测量臂，记录数据。3.酶切 3.13.2混匀后，放于37度水浴锅中，过夜酶切，约16-18小时。4.电泳4.1配制2%琼脂糖凝胶，120V电泳，约25-30分钟，4.2成像观察。试验3：BioTTT001基因组PCR及插入基因IL-12PCR验证SOP一、目的利用PCR验证BioTTT001的构建二、试剂来源、配制及保存条件三、仪器设备四、试验过程1.病毒基因组提取1.1向200ulBioTTT001原液中加入10ul蛋白酶K，混匀。1.2加入200ulALBuffer，震荡15s混匀；轻微离心后，放入56度水浴锅内，孵育10分钟。1.3加入200ul无水乙醇，震荡15s混匀；轻微离心后，转移样品到新吸附柱中。1.4离心8000转1分钟，转移吸附柱到新2ml离心管中。1.5加入500ulBufferAW1，离心8000转1分钟。1.6弃废液，向吸附柱中加入500ulBufferAW2，14000转离心3分钟。1.7弃废液，空转1分钟；将吸附柱转移到新的1.5ml离心管中。1.8向吸附柱中加入50ul超纯水，室温静置1分钟，14000转离心1 分钟2.浓度测定2.1吸取2ul超纯水，滴到样品检测孔处，进行校准。2.2抬起测量臂，擦拭残留液体。2.3吸取1ul待检测样品，滴加到样品检测处，放下测量臂，记录数据。3.PCR3.13.24.电泳4.1配制2%琼脂糖凝胶，120V电泳，约25-30分钟，4.2成像观察。附注：引物信息试验4：BioTTT001插入基因IL-12表达检测SOP(ELISA)一、目的利用ELISA检测BioTTT001插入基因IL12的表达水平二、试剂来源、配制及保存条件三、仪器设备四、试验过程1.细胞培养及铺板1.1复苏JH293一支，待细胞融合度达到80-90%时进行传代。1.2传代3-5 次，观察细胞状态良好，消化收集细胞，制备单细胞悬液。1.3利用血球计数板进行细胞计数。1.4使用含10%FBS-DMEM培养基调整细胞溶度为1.0X105/ml，2ml/孔进行铺板。1.5将六孔板放置于细胞培养箱中，过夜培养。2.病毒感染2.1培养14-18小时，观察细胞完全贴壁后，消化其中3个孔，分别进行计数，取平均值。2.2每个细胞感染5PFUBioTTT001，根据计数结果，使用无血清DMEM培养基稀释病毒，每孔加2ml含病毒的无血清DMEM。2.3细胞培养箱放置2小时，吸走含病毒培养基，2mlPBS/孔轻轻晃动清洗一次。2.4每个孔加入2ml10%FBS-DMEM培养基,放置于细胞培养箱中进行培养。3.样品收集及冻融3.1分别于感染后24h、48h、72h及96h时，收集每孔的培养基，使用200ul吸头（折弯）刮取贴壁细胞，与同孔的培养基收集于同一冻存管中；每个时间点收集三个复孔。3.2样品保存于超低温冰箱中。3.3从超低温冰箱中取出样品，放置于37度水浴锅中进行解冻。3.4样品完全解冻后，迅速将其放置于液氮中3-5分钟进行速溶，再37度水浴至完全溶解。3.5反复冻融3次。4.IL12表达的检测4.1相关试剂准备4.2包被使用多通道移液器向Coster9018ELISA96孔板每孔中加入 100ul1XCaptureAntibody，保鲜膜包裹后放入4度冰箱中，过夜。4.3洗板吸走孔中液体，清洗3次，每次每孔加入250ulWashBuffer，轻轻晃动板子1分钟，吸走清洗液，吸水纸吸干残余液体；4.4封闭每孔加入200ul1XELISADiluent，室温放置1小时。4.5标准品稀释取10ul标准品溶解于12ml1XELISADiluent中，得到浓度为500pg/ml，依照下表所示，共稀释8个梯度浓度的标准品，一4.6100ul/孔，每个样品铺3个复孔；4度过夜孵育。4.7洗板同4.3，洗3-5次。4.8孵育检测抗体每孔加入100ul1XDetectionAntibody，室温孵育1小时；同4.3洗板3-5次。4.9酶连反应每孔中加入100ul1XAvidin-HRP，室温孵育30分钟m,同4.3洗板5-7次;每孔加入100ul1XTMB，室温孵育15分钟后，每孔加入50ulStopSolution。4.10读板检测450nm吸光值，绘制标准曲线，计算样品IL12表达量。四．病毒活性检测： 试验：BioTTT001病毒活性检测SOP（Cytopethiceffectassay）一、目的利用细胞病变效应（Cytopethiceffectassay）检测BioTTT001活性二、试剂来源、配制及保存条件三、仪器设备四、试验过程1.细胞培养及铺板1.1复苏JH293一支，待细胞融合度达到80-90%时进行传代。1.2传代3-5次，观察细胞状态良好，消化收集细胞，制备单细胞悬液。1.3利用血球计数板进行细胞计数。1.4使用含10%FBS-DMEM培养基调整细胞溶度为1.0X105/ml，500ul/孔进行铺板。1.5将24孔板放置于细胞培养箱中，过夜培养。2.病毒感染2.1培养14-18小时，观察细胞完全贴壁后，消化其中3个孔，分别进行计数，取平均值。2.2感染BioTTT001及对照病毒，根据计数结果，使用无血清DMEM培养基稀释病毒，每孔加500ul含病毒的无血清DMEM；铺板如下：病毒梯度稀释：Total2000ul1350ul1350ul1350ul1350ul2000ul无血清DMEM 2.3细胞培养箱放置2小时，吸走含病毒培养基，500ul/孔PBS轻轻晃动清洗一次。2.4每个孔加入500ul10%FBS-DMEM培养基,放置于细胞培养箱中培养5天;3.结晶紫染色3.1吸走培养基，500ul/孔PBS洗一遍。3.2吸走PBS，300ul/孔4%甲醛溶液，室温固定30分钟。3.3吸走甲醛溶液，500ul/孔PBS洗一遍。3.4吸走PBS，放置于细胞培养箱中烘干。3.5每孔滴加20ul结晶紫溶液，晃动板子，至孔底完全浸染结晶紫。3.6室温放置30分钟，1ml/孔PBS洗两遍。3.7吸走PBS，烘干，拍照记录。五．体外细胞杀伤复制能力检测：试验1：BioTTT001体外细胞杀伤试验SOP一、目的检测BioTTT001对靶细胞的杀伤能力二、试剂来源、配制及保存条件三、仪器设备四、试验过程1.细胞培养及铺板1.1复苏HCPCI（叙利亚仓鼠头颈部肿瘤细胞株）一支，待细胞融合度达到80-90%时进行传代。1.2传代3-5次，观察细胞状态良好，消化收集细胞，制备单细胞悬液。1.3利用血球计数板进行细胞计数。 1.4使用含10%FBS-DMEM培养基调整细胞溶度为2.22X104/ml，90ul/孔进行铺板（104/孔）。铺板方式如下(PBS100ul/孔，2%Medium90ul/孔)：1.5将96孔板放置于细胞培养箱中，过夜培养。2.病毒感染2.1培养14-18小时，观察细胞完全贴壁。2.2感染BioTTT001，最高感染剂量为10000PFU/cell，使用2%FBS-DMEM培养基稀释病毒，每孔加10ul含相应病毒的2%FBS-DMEM；2.3感染病毒后的板子放置于细胞培养箱中培养。3.检测吸光值3.1感染6天后，加入20μlMTS和PMS20:1(MTS:PMS)混合液（下图灰色区孔），3.2检测490nm吸光值，计算EC50值。试验2：BioTTT001体外肿瘤细胞中的复制能力检测试验SOP一、目的检测BioTTT001在靶细胞内的复制能力二、试剂来源、配制及保存条件三、仪器设备四、试验过程1.细胞培养及铺板1.1复苏HCPCI （叙利亚仓鼠头颈部肿瘤细胞株）一支，待细胞融合度达到80-90%时进行传代。1.2传代3-5次，观察细胞状态良好，消化收集细胞，制备单细胞悬液。1.3利用血球计数板进行细胞计数。1.4使用含10%FBS-DMEM培养基调整细胞溶度为1.0X105/ml，2ml/孔进行铺板。1.5将六孔板放置于细胞培养箱中，过夜培养。2.病毒感染2.1培养14-18小时，观察细胞完全贴壁后，消化其中3个孔，分别进行计数，取平均值。2.2每个细胞感染5PFUBioTTT001，根据计数结果，使用无血清DMEM培养基稀释病毒，每孔加2ml含病毒的无血清DMEM。2.3细胞培养箱放置2小时，吸走含病毒培养基，2mlPBS/孔轻轻晃动清洗一次。2.4每个孔加入2ml10%FBS-DMEM培养基,放置于细胞培养箱中进行培养。3.样品收集及冻融3.1分别于感染后24h、48h、72h及96h时，收集每孔的培养基，使用200ul吸头（折弯）刮取贴壁细胞，与同孔的培养基收集于同一冻存管中；每个时间点收集三个复孔。3.2样品保存于超低温冰箱中。 3.3从超低温冰箱中取出样品，放置于37度水浴锅中进行解冻。3.4样品完全解冻后，迅速将其放置于液氮中3-5分钟进行速溶，再37度水浴至完全溶解。3.5反复冻融3次。4.滴度测定4.1复苏JH293一支，待细胞融合度达到80-90%时进行传代。4.2传代3-5次，观察细胞状态良好，消化收集细胞，制备单细胞悬液。4.3利用血球计数板进行细胞计数。4.4使用含10%FBS-DMEM培养基调整细胞溶度为1.5X104/ml，200ul/孔进行铺板。4.5总计铺12块96孔板，放置于细胞培养箱中，14-18后，观察细胞完全贴壁。4.6使用多通道移液器吸取稀释后样品20ul加到96孔板A行，吹打5次混匀；更换吸头，吸取22ulA行上清加入到B行对应孔中，吹打5次混匀；更换吸头，吸取22ulB行上清加入到C行对应孔中，吹打5次混匀;依次操作至G行；H行加入22ul10%FBS-DMEM。4.7感染后的96孔板放置于细胞培养箱中，培养10天，观察H行细胞融合度达到90%。4.8倒置显微镜下数每行出现CPE（细胞病变）的孔数，计算样品滴度及病毒复制量。