hbv感染对原发性肝细胞癌生物学行为及p53蛋白的表达影响

HBV感染对原发性肝细胞癌生物学行为及p53蛋白的表达影响临床肝胆病杂志2006年4月第22卷第2期HBV感染对原发性肝细胞癌生物学行为及p53蛋白的表达影响闽婕,冯英明,张贺龙,姬统理,李刚(中国人民解放军第四军医大学唐都医院肿瘤科,陕西西安710038)【摘要】探讨在原发性肝细胞癌(HCC)中乙型肝炎病毒(HBV)的感染对肿瘤生物学行为以及突变型p53蛋白的表达影响.利用血清学指标检测6O例HCC的HBV感染情况,采用抗生蛋白链霉素一过氧化酶法(S—P)检测癌组织中突变p53蛋白的表达.38例HBV感染HCC中突变p53蛋白的表达率为73.68%(28/38),22例非HBV感染表达率为45.45%(10/22),两者有显着差异(P<O.05).在HCC中,HBV感染与肿瘤的Edmondson分级,AFP值增高,门静脉癌栓形成,肝内转移以及转氨酶增高相关(P<0.05).HBV的感染可能与p53基因的突变共同作用导致HCC的发生及发展.同时检测以上二种指标可以为认识HCC的生物学特性,制定合理的综合治疗方案提供依据.?【关键词】肝癌;乙型肝炎病毒【中国分类号】R735.7【文献标识码】A【文章编号】1001—5256(2006102—0131—02InfluenceofHBVinflectiononbiologicalbehavioursofhepatocellularcarcinoma(HCC)andexpressionofp53protein.MINfie,FENGyng—ming,ZHANGHe—long,eta1.(DepartrnentofOncology,TangduHospita1.TheFouahMilitaryMedicalUniversityPLA,Xi"an710038,China) Abstract:Tostudytheinnuenc昌耶Vinfectiononbiologicalbehaviou~ofhepatocellularcarcinoma(HCC)andex.,-pressionofmutate053protein~ThestateofHBVinflectionweredeterminedbyserumtestsfor60patientswithhepatocellu1arcarcinoma.Meanwhile,expressionofmutated053proteincarcinomatissuesweredetectedbyusinghepatocellularstrep—tavidin—peroxidase(S—P)method.Theexpressionrate(73.68%(28/38))0f38casesofpatientscarcinomainfectedbyHBVwithhepatocellularwassignificantlyhigherthanthat(45.45%(10/22))0f22casesofpatientswithhepatocellu—larcarcinomanotinfectedbyHBV(P<0.05)AmongthepatientswithHCC,rh.patientswithhepatocellularcarcinomabeingdetected,thestatasofHBVinfectionispositivelycorrelationswithEdmondsongradestheelevationofserumOL—fectoprotein(AFP)levels,intraportalcarcinomaembolism,intrahepaticmetastasis,andelevationofserumaminotrans—ferase(P<O.05).ThestateofHBVinfectionmayjointhemutationof053proteinintheoccurrenceanddevelopmentofhepatocellularcarcinoma.TodetectthemhelpsUStolearnthebiologicaltraitsofhepatocellularcarcinomaandtodesignthemedicineplans.Keywords:hepatocellularcarcinoma;hepatitisBvirus(HBV)原发性肝癌(PHC)自90年代起居我国癌症发病率的第二位,而其中90%以上为肝细胞性肝癌(HCC).HBV的感染与HCC的发生最密切相关,而抑癌基因p53基因的突变在HCC的发生中也有重要作用J.因此就HBV感染后HCC生物学行为以及与p53蛋白表达的关系进行研究,以期为HCC 制定合理的综合治疗方案提供依据.1材料与方法1.1材料标本取自1993—2003年经手术切除并经病理学证实的HCC60例.标本经常规处理,切片,IHC染色.60例HCC中男5l例,女9例.年龄收稿日期:2005—03—07修订日期:200一一作者简介:闵婕(1973一),女,江苏苏州人,在读医学硕士,主要从事肝癌临床治疗研究.l3l2l一73岁,平均48.02岁.病理分级按Edmondson分级法分级,I级0例,Ⅱ级l6例,Ⅲ级44例,Ⅳ级0例.按全国肝癌病理协作组提出的HCC的大体分类方法,结节型14例,块状型45例,弥漫型1例.46例AFP增高.28例肝功能检查AST和ATJT增高.B超检查l7例伴有门静脉癌栓,CT检查结果及术中所见30例发生肝内转移,25例发生远处转移.所有病例均未接受化疗及放疗.根据血清学检查结果将其分为两组,HBV感染组38例,非HBV感染组22例.1.2方法与试剂鼠抗人p53单克隆抗体,正常动物非免疫性血清,生物素标记的抗体(二抗)及链霉素抗生物素一过氧化酶均购自福建迈新生物技术公司,其他试剂由本院医院病理科提供.采用免疫组化S—P法:常规石蜡切片脱蜡,3%过氧化氢甲醇———————|_132溶液浸泡30分钟,进行枸橼酸盐缓冲液高温修复. 自然冷却后抗原切片加501al正常动物非免疫性血清,室温孵化l0分钟,分别加鼠抗人p53单克隆抗体501al,4℃过夜.加生物素标记的抗体(二抗)501xl,室温孵化10分钟,加链霉素抗生物素一过氧化酶50,室温孵化l0分钟,切片滴加新鲜配置的DAB溶液,显微镜下控制染色3～10分钟,所有步骤间均用PBS冲洗.中止染色后,苏木素复染2分钟,盐酸酒精分化,水洗后梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,镜下观察.试验中用已知反应阳性的其它肿瘤切片作阳性对照,用PBS代替一抗作阴性对照.ChinJCliniHepatol,April2006,Vo1.22,No.21.3结果判断p53蛋白阳性的判断:p53阳性细胞核染成棕黄色或棕褐色,表达数<10%为阴性,(10—25)%为(+),(25—75)%为(++),>75%为(+++).1.4统计学处理统计分析方法采用检验,以P<0.05为有显着性差异.2结果2.1HBV感染与HCC生物学行为关系HBV感染与HCC病例的年龄,肿瘤直径以及远处转移的发生无统计学差异,而与HCC的Edmondson分级,门静脉癌栓的形成,AFP值的增高,肝内转移的发生以及转氨酶的增高有统计学差异(P<0.05),见表l.表1HBV感染与HCC生物学行为关系2.2HBV感染与p53蛋白表达的关系p53蛋白在HCC组织的阳性表达主要在癌细胞核中.表现为棕黄颗粒状,着色不均匀.38例HBV感染HCCp53蛋白的表达率为73.68%(28/38),22例非HBV 感染肝癌肝组织p53蛋白的表达率为50.00%(11/22),两者有显着差异(=4.33,P<0.05).3讨论实验中对60例HCC病例进行其生物学行为的总结,经统计学处理,HBV感染与HCC的Edmond.son分级,门静脉癌栓的形成,AFP值的增高,肝内转移及转氨酶的增高有统计学差异(P<0.05).以上指标均提示HBV感染与HCC具有相关性.以往的研究发现HBV的遗传物质HBV—DNA整合到人体细胞的DNA中,而HBV—DNA整合又与N—ras等癌基因的激活有关;其次还有研究报道TGFc~与HBsAg对肝癌发生与发展有协同作用曲】.尤其对于HBV的x基因的研究证实HBx通过抑制受损细胞的DNA修复等机制促进肝癌细胞的恶性生长j.p53基因是体内重要的细胞凋亡控制基因,定位于l7号染色体.野生型p53基因存在于细胞核内,在脱磷酸化时活化,有阻碍细胞进入细胞周期的作用.在许多恶性肿瘤中会发生野生型p53基因的点突变及缺失,转变为突变型p53基因,而且引起异常的基因表达,丧失正常抑癌功能,突变型p53基因在许多恶性肿瘤的发生和发展中起重要的作用8].人类约有50%的肿瘤确定存在p53基因各种类型的突变j.野生型p53基因蛋白半衰期短,利用免疫组化法只能检测突变型p53基因蛋白.本实验38例HBV感染的HCCp53蛋白的表达率与22例非HBV感染肝癌肝组织p53蛋白的表达率,两者有显着差异(P<0.05),结果提示突变型p53蛋白在HCC中与HBV感染的发生可能有关.在HCC中,不但存在野生型p53基因的突变,影响其抑癌功能,而据 Fehesonll.研究报道HBV的HBxAg可以与野生型p53结合,阻止p53进入细胞核,从而进一步使得p53蛋白失去阻止癌变的能力,二者相互作用是肝细胞癌变的重要机制.所以,在HBV感染HCC中,由于HBV感染,p53基因突变以及HBV中HBxAg与p53基因二者的相互作用等原因,使其与HCC的发生发展密切相关.进一步完善其相关研究可以为HCC的综合治疗方案的制定提供理论基础.[参考文献][1]LeevyCM,SherlockS,TygstrupN,eta1.Diseaseoftheliverandbiliarytractstandardizationofnomenclature,diagnosiscriteriaandprognosis[J].NEWYork:Ravenpress,1994:165.[2]TamoriA,NishiguchiS,KuboS,eta1.HBVDNAintergalionandHBV—transcriptexpressioninBoa—B.HOB—Chepatocellularcar.cinomainJapan[J].JMedVirol,2003,71(4):492—8.[3]SuF,TheodosisCN,SchneiderRJ.RoleofNF—koppaBandmycproteinsinapoptosisinducedbyhepatitisBvirusHBxprotein[J].JViro1.200l,75:215—225.临床肝胆病杂志2006年4月第22卷第2期[4]LeeYI,Kang—ParkS,DoSI,eta1.ThehepatitisBvirus～Xpro—teinactivatesaph0phatidylinositol3一kinase—dependentsurvivalsignalingcascade[J].JBiolChem,2001,276:16969—16977.[5]LeeSG,RhoHM.Transcriptionalrepressionofthehumanp53genebyhepatitisBviralXprotein[J].Oncogene,2000,19:468—471.[6]LianZ,LiuJ,PanJ,eta1.Acellulargeneup—regulatedbyhepa-tiffsBvirus—encodedXantigenpromoteshepatocellulargrowthandsurival[J].JHepatology,2001.34:146—157. 『7]LeveillardT,Andera1,BissonnetteN,etal1.Functionalinteractionsbetweenp53andtheTFIIHcomplexandaffectedbytumor—-associat-l33edmutations[J].EMBOGJ,1996,15(7):1615.[8]ReevesME,DeMatteoRP.Genesandvirusesinhepatobiliaryneo-plasia[J].SeminSurgOncol,2000,19(2):84.[9]HarrisCC.pS3:Atthecrossroadsofmolecularcarcinogenesisandriskassessment[J].Science,1993,262(10):1980—1981.[10]FehesonMA,ZhuMH,DuanLX,eta1.hepatitisBXantigenandP53areassociatedinvitroandinlivertissuesfrompatientswithpri—maryhepatocellularcarcinoma[J].Oncogene.1993,8:1100—1】17.顺铂和苦参素对人肝癌细胞株HepG2端粒酶活性的影响左国庆,何松.张(1.重庆医科大学附属第二医院消化内科,重庆400010;2燕,汤为学重庆医科大学病理生理学教研室,重庆400016)【摘要】观察顺铂,苦参素对人肝癌细胞株HepG2端粒酶活性的影响,进一步探讨两种药物的可能作用机制.采用人肝癌细胞株HepG2作为研究对象,Mrr法检测不同浓度和作用时间的药物对细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪分析细胞周期的分布及凋亡;PCR—ELISA法检测端粒酶活性的变化.两种药物均具有抗HepG2细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导凋亡及抑制端粒酶活性的作用.对端粒酶活性的抑制可能是两种药物发挥抗肿瘤作用的机制之一.【关键词】肝细胞癌;端粒酶;顺铂;苦参素【中图分类号】R735.7【文献标识码】A【文章编号】1001—5256(2006)02一O133一-o3 TheeffectsofcisplatinandmatrineontelomeraseactivityinhumanhepatomacelllineHepG2ZUOGuo—qing.HESong.ZHANGYah,eta1.(DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingUniversityofMedicalSciences,Chongqing)Abstract:Toinvestigatetheanti—cancermechanismofcisplatinandmatrinebyobservingtheireffectsontelo,neraseactivi-ty.TheinhibitionofproliferationinHepG2cellswereestimatedbyM1Tr—test.Distributionofcellcycleandapoptosiswereanalysedusingflowcytometry.ThechangesoftelomeraseactivityweredetectedbyPCR—ELISAmethod.ThetwodrugscouldinhibittheproliferationofHepG2,blockcellcycle,induceapoptosisandinhibittheactivityoftelomerase.Theinhibitionoftelorueraseactivitymaybeoneofthemechanismsoftheanti—cancereffectofthetwodrugs.Keywords:hepatocellularcarcinoma;telomerase;cisplatin;matrine顺铂(CDDP)名为顺式一二氨二氯合铂(Ⅱ),具有以下特点:抗癌活性强;毒性谱与其它药物不同,故容易与其它抗癌药物配伍;与其它抗癌药物较少产生交叉耐药,有利于临床联合用药….苦参素又名氧化苦参碱(Oxymatfine),是从豆科植物苦豆草的种子苦豆子中提取的一种生物碱,有抗炎,抗病毒,抗肝纤维化,保肝降酶,升高白细胞和抗心率失常等多种药理作用J.本文以顺铂和苦参素对端收稿日期:2004—11—30修订日期:2005—01—21作者简介:左国庆(1963),男,四川绵阳人,主任医师,医学硕士主要从事酒精性肝病和原发性肝癌的研究.粒酶活性改变为切入点,观察顺铂和苦参素对人肝癌细胞株HepG2端粒酶活性的影响,以进一步探讨它们在肿瘤治疗中的作用机制. 1材料与方法1.1细胞株人肝癌细胞株HepG2由重庆医科大学附属第二医院肝炎研究所提供,接种在含10%小牛血清,青霉素100u/ml,链霉素lOOu/ml的RP—MI1640(G1BCO,美国)培养液中,置于37,5%CO,培养箱(SHEL—LAB2300型,美国)内培养.1.2药品与试剂CDDP(Cisplatin,山东省德州制药厂),苦参素注射液(Marineinjection,宁夏启元药业有限公司).上述两种药物使用时均配制成五种