噬菌体生物扩增法检测肺泡灌洗液结核分枝杆菌临床探究

噬菌体生物扩增法检测肺泡灌洗液结核分枝杆菌临床探究【摘要】目的:探讨噬菌体生物扩增法(phaB)检测肺泡灌洗液中结核分枝杆菌的临床应用价值。方法:收集疑诊为肺结核,未予抗结核的初治患者肺泡灌洗液标本80例,同时应用PhaB法、荧光涂片法、聚合酶链反应技术法(PCR检测法)、罗氏培养法进行检测,对照分析检测结果。结果:80例患者纤支镜检查有46例发现异常,使用PhaB法、荧光涂片法、聚合酶链反应技术、罗氏培养法检查阳性率分别为58.8%、47.5%、65%、76.3%;PhaB法和聚合酶链反应技术两种方法联合检测敏感性为88.5%,特异性为89.5%。结论:PhaB检测疑诊为肺结核的未予抗结核患者肺泡灌洗液结核分枝杆菌,有较高的敏感性和特异性,联合荧光涂片法和聚合酶链反应技术检测可进一步提高其敏感性。【关键词】噬菌体生物扩增法;聚合酶链反应技术;结核;分枝杆菌【中图分类号】R378.91+1【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)16-159-29 结核分枝杆菌感染人体而引发的结核病是全球性的严重危害人类的传染性疾病之一。我国作为发展中国家,结核病的控制更是任重道远。在结核病控制中,寻求经济,快速,敏感性和特异性较高的结核菌检测方法,为结核的早期诊断提供依据是众多临床医师所希望。目前痰荧光涂片灵敏度较差,并受痰样本数和病情的影响,一般认为活动性肺结核涂阳率约40-50%[1];罗氏培养法阳性率较高约50-80%[1],但需要平均时间约4-8周。本研究通过PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法检测肺泡灌洗液中结核分枝杆菌,通过对照评价PhaB法在肺结核诊断中的使用价值及优缺点。1资料与方法1.1临床资料选取2008-2010年广州市胸科医院疑诊初治肺结核住院患者80例,其中男性35例,女性25例,年龄19～65岁,平均年龄38.5±7.5岁。入选条件:疑诊为初治肺结核并支气管结核,未开始抗结核治疗;三个月内未接受喹诺酮类和氨基糖甙类抗生素治疗。1.2方法1.2.1PhaB法结核分枝杆菌噬菌体生物扩增试剂盒(FASTplaueTB)由英国BDTEC公司生产,由上海市金浩科技发展有限公司提供。9 1.2.2支气管冲洗液标本收集按支气管镜检查常规进行术前准备和麻醉,通过胸部CT或胸片初步确定重点检查部位。气管镜经鼻腔进入,通过声门逐步检查气管,支气管。对镜下可见病变部位,可先后进行支气管粘膜活检和支气管刷检,随后进行支气管冲洗,将生理盐水5～10毫升注入相应的肺叶和肺段病变部位进行冲洗,用吸引器将冲洗液收集入标本瓶中送检,共2-3次。对镜下病变部位不明显处,将纤支镜插入病灶最多部位所在的支气管开口按上述方法进行刷检、冲洗,留取标本。1.2.3噬菌体生物扩增法按试剂盒(FASTPlaqueTBTM)说明书配制所需试剂,包括培养基-生物添加剂、琼脂、噬菌体和敏感细胞等,全部操作在无菌操作台进行。肺泡灌洗液洗标本的处理:取灌洗液标本5ml,加入1倍体积的4%NAOH溶液混匀常温静置15min去污染。加入磷酸缓冲液(PH6.8)离心20min,弃去上清液。重悬沉淀物,4000g离心15min,弃去上清液,重悬沉淀物,无菌条件下吸取1ml重悬液加入孵育管中,37℃孵育24小时。检测:每次取1ml处理后的样品加入各反应管中,阴性对照不加标本,阳性对照加入1:1000稀释度的敏感细胞液。加入100ul噬菌体溶液在37℃条件下培育1h。在每个反应管中加入100ul强效杀毒剂溶液,上下充分混匀,室温放置5min后加入5ml培养基-生长添加剂和1ml敏感细胞液。将反应管中所有反应混合物倒入培养皿中,加入5ml融化的琼脂,快速混匀静置成型。37℃温育18-24小时后观察结果。结果判断:噬菌斑数�19个阴性,�20个位阳性。9 1.2.4其他检测方法荧光涂片法:用金胺“O”荧光染色涂片法,荧光显微镜检每50个视野≥10-99条抗酸杆菌为阳性;结核菌培养:用BacT/Alert3D全自动分枝杆菌快速培养仪按照仪器使用说明书进行临床标本的分离培养;荧光定量聚合酶链反应技术(PCR检测):检测冲洗液结核分枝杆菌DNA片段,TB-DNA基因拷贝数量>1×103拷贝/mL阳性1.2.5统计学处理采用SPSS统计软件进行分析,用X2检验比较不同检测方法的阳性率,P0.05),提示两者阳性检出率类似;PhaB法与罗氏培养法比较检验有显著性差异(X2=12.07,P0.05)。表一80例初步诊断肺结核肺泡灌洗液使用PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法进行检测阳性结果方法标本例数阳性例数阳性检出率(%)①PhaB法804758.8②荧光涂片法803847.5③PCR检测805265①③两种方法联合805872.5④罗氏培养法806176.3PhaB法检出的47份阳性标本中,荧光涂片法检出35例阳性;PhaB法检出的33份阴性标本中,荧光涂片法检出30例阴性。PCR法检测的52份阳性标本中,PhaB法检出41份,检出率78.8%;罗氏培养法阳性的61例标本中,PhaB法检测出44份,检出率72.1%。9 表二80例初步诊断肺结核肺泡灌洗液使用PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法进行检测结果比较荧光涂片法PCR检测法罗氏培养法阳性阴性阳性阴性阳性阴性PhaB法阳性(n=47)3512452470阴性(n=33)3307261419合计3842522861193讨论1997年wilson等[2]人发现众多的噬菌体中有一种分枝杆菌噬菌体能感染结核分枝杆菌和少数几种非结核分枝杆菌。在经过处理的标9 本中加入结核分枝杆菌噬菌体,使噬菌体和分枝杆菌结合,随后加入杀毒剂灭活未感染分枝杆菌的噬菌体。噬菌体在受感染的分枝杆菌内,利用其代谢酶系进行大量繁殖。当分枝杆菌破裂,大量的子代噬菌体被释放,感染加入的敏感指示细菌,在培养基上经培养形成噬菌体空斑。当空斑数量>20个为阳性,否则为阴性。阳性的标本间接提示原标本有结核分枝杆菌或少数的几种非结核分枝杆菌。这构成了噬菌体法检测分枝杆菌的理论基础[3]。据国外资料报道,2002年南非Albert[4]等人对疑似肺结核患者,以罗氏培养法为金标准,噬菌体法对痰标本检测的敏感性73%,特异性为99%;巴基斯坦Muzaffar[5]等人用类似方法测得噬菌体法的敏感性82%,特异性98%;国内于秀丽[6]等人用BACTECMGIT980快速培养法作为金标准,测得噬菌体法检测痰中结核分枝杆菌的敏感性为86.4%,特异性83.9%。均显示噬菌体法对痰中分枝杆菌检测有较高的敏感性和特异性。9 本研究用噬菌体生物扩增法、荧光涂片法、聚合酶链反应技术、罗氏培养法共4种方法同时检测不同的纤支镜肺泡灌洗液标本80份。PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法阳性检出率分别为58.8%,47.5%,65%,76.3%。PhaB法和荧光涂片法阳性率比较,差异有显著性意义(X2=4.27,P0.05);噬菌体生物扩增法以罗氏培养法为金标准,结果提示其敏感性77%,特异性100%,阳性预测值100%,阴性预测值57.6%。和国外以痰标本PhaB法检测报道结果相似[4]。联合PhaB法和荧光涂片法检测敏感性为81.2%,特异性为100%,阳性预测值100%,阴性预测值57.6%;联合PhaB法和PCR检测法检测敏感性为88.5%,特异性为89.5%,阳性预测值96.3%,阴性预测值89.5%。提示联合PhaB法和PCR检测法,能快速诊断肺结核,有较高的敏感性和特异性,在临床中可能有较大的实用价值。这有待于更大的标本量进一步验证。结核分枝杆菌细菌学检测是诊断结核的金标准之一,但患者排菌情况受结核病发现时期较大影响,对早期以渗出、增殖为主的病理改变,排菌量较小;而发生坏死,空洞形成的患者相对排菌量较大。同时病灶相连的支气管引流是否通畅也影响远端气管内分泌物的排出,影响到痰结核菌的检查。本组病例肺泡灌洗液标本PhaB法阳性检测率较高,除了与病例的选择有关,考虑原因:支气管镜检查对支气管、肺泡的机械性刺激,活检钳和毛刷损伤支气管壁和病灶边缘,同时在在纤支镜活检和刷检后灌洗可起到疏通支气管,促进远端分泌物的排出。用生理盐水在病变部位注入远端气道和肺实质,接触病灶范围较广,负压吸引收集冲洗液较多,细菌量较大,深部的结核菌可能被收集到冲洗液中。肺泡灌洗液对支气管有刺激作用,可以诱发部分患者咳嗽,有利于深部结核菌的排出,获得结核菌的机会增多[7]。另外,PhaB法是通过噬菌体感染结核分枝杆菌,而结核分枝杆菌受一些理化因素作用,表面受体发生细微变化可能导致不能被噬菌体感染[8]。相对痰标本,肺泡灌洗液标本受理化因素影响较小。9 总结噬菌体生物扩增法对肺泡灌洗液标本分枝杆菌检测的临床应用。PhaB法操作简便,获取结果快速(2天),相对荧光涂片法有较高的敏感性和特异性。对PhaB法分枝杆菌检测高特异性,临床可以用于结核杆菌和非结核分枝杆菌的菌种鉴定[9]。针对噬菌体必须感染活的结核菌特性,临床中还可以对标本加入不同的结核药,对照不加药标本,筛查结核菌株对不同结核药的耐药性[2]。参考文献[1]马屿,朱莉贞,潘毓萱.结核病[M].北京:人民卫生出版社,2006:103-108.[2]WLSONSM,ALSUWADIZ,MCNERNEYR,etalEvaluationofannewrapidbacteriophage-basemedthodforthedrugsusceptibilitytestingofMycobacteriumtuberculosis[J].Natmed,1997,3:465-469.[3]彭丽,罗永艾,王国治.噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌标准化研究[J].中华结核和呼吸杂志,2004,27(12):806-810.[4]ALberH,HeydenrychA,BrookesR,etalPerformanceofarapidphage-basedtest,FASTPlaqueTBTM,todiagnosepulmonarytuberculosisfromsputumspecimensinSouthAfica[J].IntJTubercLungDis,2002,6:529-537.[5]MuzaffarR,BatoolS,AzizF,etalEvalutionoftheFASTPlaqueTBassayfordirectionofmycobacteriumtuberculosisinsputumspecimens[J].IntJTubercLungDis,2002,6:635-640.9 [6]于秀丽,王秋月,李艳玲.噬菌体生物扩增法快速检测痰结核分枝杆菌的临床研究[J].中国实用内科杂志,2007,27(11):1697-1699.[7]常占平,彭勋,王洪芬,等.纤维支气管镜检查对无痰或痰菌阴性不典型肺结核的诊断价值[J].中华临床医师杂志,2008,2(8):922-926.[8]林健雄,黄国盛,赵立文,等.噬菌体裂解法与涂片法对肺结核的诊断价值比较[J].临床肺科杂志,2005,10(7):429-430.[9]庞茂银,胡忠义,勒安家,等.噬菌体裂解法与BACTEC-460法在结核分枝杆菌快速检测中的比较,2003,21(4):27-29.9