分子细胞生物学复习资料

分子细胞生物学1．分子细胞生物学的研究方法；2．近年来蛋白质和核酸的结构和功能研究进展；3．生物膜运输物质的分子机理；4．细胞各部位蛋白质的合成和定向运输的分子机理；5．细胞核的分子结构以及细胞核和细胞质之间物质运输的分子基础；6．细胞信号传导的分子机理。第一章分子细胞生物学学科简介和研究方法本章重点难点：分子水平上的操作技术。一、分子细胞生物学的研究对象和内容p1-2二、分子细胞生物学与其他学科的关系p1-2三、分子细胞生物学的研究方法-（一）、研究细胞的组成和结构1.荧光显微镜下鉴别细胞的组成和结构p2-4（1）免疫荧光法（2）活细胞研究（3）检测局部Ca2+浓度和细胞内的pH（4）共聚焦扫描显微镜展示细胞内物质的立体分布2.在电子显微镜下鉴别细胞中的各种蛋白质的分布和超微结构p4利用抗体和抗原特异性结合的原理，电子致密度大的物质（金颗粒）作为标记，蛋白A起桥梁作用（蛋白A能同抗体Fc片段结合）。3．鉴定蛋白质的亚细胞定位或特殊细胞定位p5（1）将目标基因与标记基因（荧光蛋白基因GFP、RFP、YFP）融合，确定目标蛋白质的亚细胞定位（2）用目标基因的启动子驱动标记基因，确定目标蛋白质在不同细胞中的分布，时空表达特点等27 （3）荧光显微镜或共聚焦扫描显微镜例如：GUS，葡糖醛酸酶，可催化化学反应，加入底物后有GUS表达的位置显蓝色。4.蛋白质亚细胞定位和超微结构定位的对比鉴定p6标记蛋白miniSOG（小型单线痒制造者，有黄素蛋白、向光蛋白2等），表达后会发出绿色荧光，蓝光下miniSOG产生单线态氧可局部催化二氨基联苯胺（DAB）聚合形成嗜锇产物，嗜锇产物店子致密度高-电子显微镜下可见。5.检测大量元素和微量元素在细胞内的分布p6（1）用Na2S沉淀金属离子（2）用透射电子显微镜-能量散射广谱仪分析细胞营养元素的分布（二）、细胞的分离和细胞器的分离1.流向细胞分类器，荧光激活细胞分类器p7具体特点见ppt2.激光捕获微分离系统p7具体特点见ppt激光捕获显微切割即Lasercapturemicrodissection(LCM)technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，成功地解决了组织中的细胞异质性问题，从而可以进行纯细胞的蛋白质组研究。其原理是用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上，然后用红外激光熔化膜，这时膜与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目标细胞留在膜上，这些细胞直接在膜上进行裂解，再进行2DE分离及蛋白质组分析或用SELDIT0F进行分离与分析。此方法大大提高了随后分析(2DE，SELDI．TOF等)的重现性和准确性，是目前较为理想的细胞提取工具，已经用于膀胱癌、结肠癌等标本的准备3.细胞亚微结构的分级分离p7-8（1）差速离心法.（根据细胞亚微结构的颗粒大小和密度差别，采用不同离心速度分离各种结构）（2）27 密度梯度离心法（根据亚微结构的密度差别达到离心的目的，用蔗糖、甘油或氯化铯作为密度梯度的介质，高速离心机40000r/min，被分离物质分布在相应的密度带内）（1）激光剪（三）、生物大分子的操作1.放射性同位素是跟踪生物大分子活动必不可少的工具（1）放射自显影术（主要用于核酸）p8-9分类a：整体放射自显影（用肉眼观察，RFLP技术中，32p标记的DNA的放射自显影）b:体外培养细胞的放射自显影（借助显微镜观察，将细胞放在盖玻片上培养）c:显微（超微）放射自显影（借助显微镜或电子显微镜观察，含放射性同位素组织切片的放射自显影）感光材料：X光胶片，液体乳胶（2）放射性同位素的定量测定p9-10种类：a：盖革计数器（常用于检测污染，特点见ppt）b:液闪计数器（特点和例子见ppt）（3）脉冲-跟踪技术p10-11（采用同位素跟踪技术研究生物大分子代谢活动的方法）基本步骤和研究实例见ppt2.确定核酸和蛋白质分子的大小以及分离和纯化核酸和蛋白质（1）电泳法p11（需要从凝胶中进一步分离大分子，分离效果好，分离量小）a．琼脂糖凝胶p11b.电泳脉冲电泳p11c.等点聚焦p12d.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳p12e.双向电泳p12f.PAGEp12脉冲场凝脉电泳(Pulsedfieldgelelectrophoresis，PFGE)，是近年发展起来的一种重要的分离大分子量线性DNA分子的电泳技术。PFGE的基本原理是在琼脂糖凝胶上外加交变的脉冲电场，其方向、时间和电流大小交替改变，每当电场方向发生改变时，大分子DNA便滞留在凝胶孔内，直至沿新的电场轴重新定向后，才能继续向前泳动，DNA分子越大，这种重新定向需要的时间就越长，当DNA分子改变方向的时间小于脉冲时间时，DNA就可以按照其分子量大小分开，经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。等电聚焦电泳等电聚焦电泳（IFE，isoelectricfocusingelectrophoresis）　　利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点27 （pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。基本原理在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。（1）离心法p13（方便，分离量大，分离效果不如电泳法好）速率-区带离心法p13密度梯度离心p13（2）色谱法p14（常用此法大量分离未变性的蛋白质和DNA,色谱柱越长分离效果越好，自制色谱柱）凝胶过滤色谱法p14离子交换色谱法p14亲和力色谱法p14-15（3）透析p15(将蛋白质或核酸与其它小分子和离子分开)（4）PCR技术p15u简并引物（degenerateprimer）定义：获得序列未完全清楚的核酸的一种引物设计方案，特点是所设计的引物序列某位置的核苷酸可以分别是两个或两个以上不同的碱基，结果所合成的引物是该位置上不同序列的混合物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。　　核苷酸链中除出现正常的A、T、G、C四种碱基符号外还出现如R、Y、M、K等其它字母（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T,N=A/C/G/T）。u巢式引物（nestedprimer）定义：为巢式聚合酶链反应所设计的引物，第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的。巢式PCR27 定义：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片断。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片断。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。从而提高反应的特异性。巢式PCR，可以在10的六次方基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，也不像二次PCR容易产生成片的产物，是效果最好的PCR，但也因此是最容易污染的PCR。u实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1.Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。2.荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-153.Ct值与起始模板的关系    研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。4.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：27 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图3所示。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。1.确定蛋白质的氨基酸成分（1）蛋白质的氨基酸组成p15分解蛋白质成游离氨基酸（6NHCl，110度，24h）离子交换色谱法分离不同的氨基酸并确定其含量（氨基酸分析仪）（2）蛋白质的氨基酸序列p16降解法：异硫氰酸苯酯（特异性与肽链氨基端aa结合在一起，成环后脱下一个aa，可循环）微酸环境离子交换色谱法确定环状化合物的性质氨基酸测序仪（3）用抗体检测蛋白质并作定量分析p16①ELISA两级抗体，酶或荧光物质作为标记物，灵敏度很高②Westernblot灵敏度高，能检测出非常少量的蛋白质2.确定DNA序列（1）传统测序法--双脱氧链终止法p16（2）新一代测序技术p1727 （四）、生物芯片技术A．生物芯片技术是一种大通量的生物分析技术（效率高，准确率高，所需样品量小）；生物芯片是这一分析技术中的信息储存或分析的材料。1.主动式芯片技术p18-17（概念特点见ppt）（1）PCR芯片（2）心脏内置芯片（3）胎儿异常红细胞分离芯片2.被动式芯片技术（1）寡核苷酸芯片技术p19-20主要用途，所需设备，工作原理，举例，优点，缺点见ppt（2）基因芯片技术p20-22种类，支撑物，命名，设备，用途，原理，优点，缺点见ppt（3）蛋白质芯片技术p22研究蛋白质间的互作；研究蛋白质与DNA之间的互作；药物筛选。（4）细胞芯片（5）组织芯片（6）全基因组覆瓦式寡核苷酸芯片技术p22在全基因组水平上分析基因表达分析DNA和RNA水平上调控基因表达的调控成分其他用途：鉴定DNA缺失或插入突变体B．基于测序的全基因组表达分析技术（转录组技术；数字基因表达谱）p22基于测序的全基因组表达分析技术与全基因芯片技术比较：可以发现新基因；鉴定不同的转录本；数据分析相对复杂；成本相对高。（五）、生物信息学分析方法生物信息学是生命科学领域和信息科学领域一门新兴的、应用型交叉学科，采用27 数理和信息科学的理论、技术和方法分析生物数据，为人类解释生命现象提供一条心途径。1.分析核苷酸序列和结构p23①基因功能预测：BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。BLAST结果中的得分是对一种对相似性的统计说明。　　BLAST采用一种局部的算法获得两个序列中具有相似性的序列。BLAST的功能　　BLAST对一条或多条序列(可以是任何形式的序列)在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对。BLAST还能发现具有缺口的能比对上的序列。②基因结构预测：GenScan③基因evolution④基因mutation2.分析蛋白质序列和结构p233.分析蛋白质的三维结构p24（六）、分离和克隆基因1.同源序列法p242.差异筛选法p243.突变体法(转座子和反转座子标签法;T-DNA插入法)p244.图位克隆法p25-27原理:用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用于目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，在利用此物理图谱通过染色体步移逐步逼近目的基因或通过染色体登陆的方法，最终克隆目的基因并通过遗传转化实验可以研究目的基因的功能。步骤(1)建立目的基因的遗传分离群体(2)找到与目的基因紧密连锁的分子标记27 (3)用遗传图或物理作图将目的基因定位在染色体特定位置(4)构建含有大插入片段的基因组文库(5)以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库(6)用阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群(7)通过染色体步移、登陆或跳查，获得含有目标基因的大片段克隆(8)通过亚克隆获得目标的小片段克隆(9)通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的碱基序列。（七）、蛋白质组学的研究方法1.鉴定蛋白质的功能p28-292.研究蛋白质的功能状态p293.研究蛋白质的相互作用p29-30(1)蛋白质芯片技术(2)酵母双杂交系统p29-30(3)免疫共沉淀技术p30免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的ProteinA或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的ProteinA或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—ProteinA或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。(4)双分子荧光技术p304.研究蛋白质-DNA互作p30-31(1)酵母单杂交系统p30(2)凝胶阻滞技术p31(原理见ppt)27 (3)染色质免疫共沉淀技术p31(原理见ppt)第二章细胞的分子组成本章重点难点：蛋白质和核酸的结构特点和与此相关的功能。一、蛋白质（一）、蛋白质的基本结构特点1.Motif（模体）（1）Helix-loop-helix（2）Zincfingermotif（3）Coiled-coilmotif2.Domain（结构域）3.三维结构相似的蛋白质多有相似的氨基酸序列4.伴侣蛋白5.蛋白质具有传染疾病的能力（二）、酶（三）、抗体1.抗体可区分非常相似的分子2.抗体可用来分离和纯合蛋白质3.单克隆抗体及其应用4.抗体可催化化学反应二、核酸（一）、核酸研究的新技术－给染色体着色（二）、反义链技术在生产和医疗上的应用（三）、基因表达的调控1.发育过程中基因表达的调控－甲基化2.RNA水平上的基因沉默（4）抑制基因的活性27 （1）发育过程中调控基因的表达3.RNA引导的DNA甲基化4.依赖于RNAi的异染色质形成（四）、RNA在医学临床上的应用1.RNA介导的基因表达抑制（2）反义RNA技术（3）Trans-cleavingribozymes（4）RNA干扰技术2.RNA介导的基因修复3.RNA与蛋白质相互作用（五）、RNA在特殊位置被降解或沉默（六）、植物染色体的共线性4.不同物种间染色体上基因排列顺序相似5.水稻不同染色体之间也具有一定程度的共线性三、脂类（一）、生物膜的主要组成成分6.微团7.脂质双层8.脂质体（二）、Leptin调控脂类代谢一、糖（一）、细胞表面糖类性质的变化与细胞的生长发育和病变密切相关（二）、糖分子参于细胞中大分子的定向输送以及细胞－细胞识别过程1.大分子定向输送2.细胞间相互识别第三章细胞膜和物质运输（8学时）本章重点难点：生物膜对各种物质的运输机制。27 一、细胞膜的结构特点（一）、细胞膜的脂质双层由不同脂类分子构成（二）、构成细胞膜的脂类和蛋白质可在细胞膜中运动（三）、细胞膜蛋白质与细胞骨骼的连接影响蛋白质的排列和可动性（四）、细胞膜的流动性取决于组成细胞膜的脂类成分和温度1.温度2.脂类成分（五）、细胞外被使大多数细胞的表面带负电荷二、细胞膜的物质运输（一）、膜运输蛋白分类1.泵2.通道蛋白3.运输子（1）Uniporter（2）Symporter（3）Antiporter（二）、被动运输1.简单扩散（1）借助于脂质双层扩散（2）借助于通道蛋白扩散2.协助扩散3.细胞－细胞通道（1）缝隙连接中的通道（2）胞间连丝中的通道（三）、主动运输1.泵类运输蛋白的分类（1）P类27 （1）V类（2）F类（3）ABC类2.钠钾离子泵3.钙离子泵4.氢离子泵5.ABC运输蛋白6.癌细胞的细胞膜对多种药物的运输（四）、伴随运输1.同向伴随运输（1）葡萄糖和氨基酸与钠离子伴随运输（2）含氢离子的同向伴随运输2.反向伴随运输（1）钙离子－钠离子反向伴随运输（2）反向伴随运输调节细胞中的pH（3）含阴离子的反向伴随运输（4）植物和真菌细胞中的液泡上存在多个反向伴随运输系统（五）、代谢过程伴随物质运输（六）、蛋白质的运输1.NH2－末端信号肽2.膜受体3.跨膜蛋白质通道4.蛋白质移动装置－马达蛋白（1）热激蛋白70（2）SecA（3）与核蛋白体有关联的蛋白质合成因子5.蛋白质折叠形成三维结构27 （七）、水的运输（渗透压作用）和细胞体积的调节1.动物细胞可通过调节细胞内渗透压维持其正常体积2.植物细胞通过改变细胞内的渗透压控制叶片气孔的开关（八）、内吞作用1.受体调节的内吞作用（1）被运输物质与受体结合和内吞作用（2）Clathrin在内吞进细胞中的膜泡外形成网络样外套（3）酸性环境使被内吞的物种与受体分开（4）大多数膜受体和形成内吞小体的生物膜被再利用（5）细胞对高密度脂蛋白（HDL）的内吞作用2.依赖于小窝（caveolae）的内吞作用（九）、病毒和毒素入侵细胞1.许多病毒通过内吞作用进入细胞2.HIV和其它膜包病毒通过与细胞膜融合进入细胞第四章生物膜、分泌蛋白质、溶酶体蛋白质的生物合成和分配（6学时）本章重点难点：蛋白质合成、修饰和定向分配的分子机制。一、细胞膜脂类物质的合成（一）、磷脂在生物膜的界面合成（二）、蛋白质flippase使新合成的磷脂分子分布到生物膜的两脂质层（三）、动、植物细胞中其它生物膜的磷脂来源于滑面内质网二、膜蛋白质、分泌蛋白质和溶酶体蛋白质的合成（一）、新合成肽链的信号肽引导核蛋白体附着在内质网上（二）、肽链穿过内质网膜进入内质网腔1.信号识别蛋白2.信号识别蛋白受体3.膜通道蛋白质4.伴侣蛋白Bip27 （三）、合成结束的分泌蛋白质穿过内质网膜进入内质网腔（四）、膜蛋白质合成1.跨膜一次，NH3+端在内质网中，COO-端在细胞基质中2.跨膜一次，NH3+端在细胞基质中，COO-端在内质网中3.跨膜几次4.蛋白质的一端镶嵌在生物膜中5.膜附着蛋白质（五）、内质网中蛋白质的修饰1.二硫键在肽链合成过程中或合成刚结束就形成2.形成多聚体蛋白质（六）、内质网中蛋白质的定向输送1.只有正常三维结构的蛋白质才能被送到高尔基复合体2.N－连接糖链在定向输送中的作用3.内质网中异常三维结构蛋白质的降解4.内质网中蛋白质的聚集5.内质网蛋白质被选择性地留在内质网中（七）、高尔基复合体中蛋白质的修饰1.O－连接糖蛋白的形成2.N－连接糖蛋白的形成（八）、高尔基复合体中蛋白质的定向输送1.甘露糖－6－磷酸是溶酶体蛋白质的标志2.前肽引导蛋白质到液泡3.蛋白质的调节分泌和连续分泌4.细胞膜不同部位蛋白质的定向输送（九）、高尔基复合体是循环使用细胞膜的主要位点（十）、蛋白质合成中的最后修饰－从前体蛋白质到成熟蛋白质（十一）、运输小泡和蛋白质的定向输送27 1.蛋白质外套和运输小泡的形成（1）Clathrin（2）Coatomer（3）COPII蛋白质2.运输小泡和受体膜融合3.蛋白质的定向输送（1）带运输信号的蛋白质被运输到指定部位（2）带滞留信号的蛋白质被留在原处（3）即无运输信号又无滞留信号的蛋白质通过bulkflow被运输4.高尔基复合体囊泡间的运输小泡流向5.磷酸肌醇参于调节运输小泡的形成和运输第五章细胞核、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体的形成（4学时）本章重点难点：细胞核的分子结构以及细胞核、线粒体、叶绿体和过氧化物酶体蛋白质的跨膜运输机理。一、细胞核的形成（一）、核膜的形成和分解5-11.板层状蛋白质是决定核结构的主要因素5-1LaminaABC核内膜上有laminB的受体板层状蛋白与染色质结合2.板层状蛋白质磷酸化与核膜解体相关5-1有丝分裂促进因子（MPF）中的蛋白激酶使板层状蛋白磷酸化，导致板层状蛋白解聚，导致核膜解体，染色质浓缩3.染色质解聚和板层状蛋白质的去磷酸化使核膜再形成5-2与2相反过程（二）、核质运输5-227 核质通道：核孔复合体nuclearporecomplex;nuclearpore[complex]定义1：核被膜上沟通核质和细胞质的复杂隧道结构，由多种核孔蛋白构成。隧道的内、外口和中央有由核糖核蛋白组成的颗粒。对进出核的物质有控制作用。　　核孔复合体是指镶嵌在核孔上的一种复杂的结构。主要有以下四种结构组分：　　1.胞质环：位于核孔边缘的胞质面一侧，又称外环；　　2.核质环：位于核孔边缘的核质面一侧，又称内环；　　3.辐：由核孔边缘伸向中心，呈辐射状八重对的纤维；　　4.栓：又称中央栓。位于核孔中心，呈颗粒状或棒状。　　核孔复合体对于垂直于核膜通富哦中心的轴呈辐射状八重对称结构，而相对于平行核膜面则是不对称的。　　核孔复合体的功能是核质交换的双向选择性亲水通道，是一种特殊的跨膜运输的蛋白质复合体。他具有双功能和双向性。双功能表现在两种运输方式：被动扩散与主动运输。双向性表现在既介导蛋白质的入核运输，又介导RNARNP等得出核运输。　　1.多数蛋白质是有选择性地进入细胞核2.不同氨基酸序列引导不同蛋白质的核质运输5-2输入NLS输出NES（1）蛋白质输入进细胞核5-3NLS受体、Ran（GTP酶）、GEF（鸟苷酸转化蛋白。使GTP取代GDP）、GAP（GTP激活蛋白）、输入模式机制27 细胞质中，NLS受体识别并结合目标蛋白并在Ran-GDP的共同作用下将其转运通过核孔复合物进入细胞质，进入细胞核之后受体与蛋白分开，在GEF的作用下Ran-GDP转换为Ran-GTP，构型改变，与受体亲和力提高，讲受体运输至核外，在核外，GAP水解GTP为GDP，亲和力降低与受体分开，受体得以再利用（1）蛋白质跨膜运输5-3耗能Ran分解GTP作为动力4.蛋白质的输出输出信号蛋白与NES受体结合与Ran-GTP结合后运出细胞核，在细胞质中GAP水解GTP，受体构型改变与蛋白质分开，受体与Ran-GDP结合进入细胞核中，得以再利用。Ran、受体输出模式机制5.RNA－蛋白质复合体的输出5-4RNA必须与蛋白质结合后以符合体的形式被运输出细胞核6.磷酸肌醇在核质运输和基因调控中的作用5-4不仅参与核运输，调控gene，还在分子通讯中起作用（三）、核的分子结构1.间期核的结构5-5每条染色体占据一个独立的区域，每个区域被interchromosomaldomain的通道分隔，起通道分隔是RNA修饰和运输的场所，有利于物质运输2.核内染色体的运动5-6可能与复制有关3.异染色质调控基因表达异染色质蛋白质抑制与它们接触的基因的表达二、线粒体的形成5-6（一）、线粒体DNA和RNA5-71.动植物线粒体DNA来源于单亲2.不同细胞中的线粒体DNA差别悬殊（二）、多数线粒体蛋白质在细胞基质中合成三、叶绿体的形成5-8（一）、叶绿体DNA和RNA（二）、叶绿体蛋白质的合成和运输见书P15927 （三）、叶绿体由前质体形成书P162四、过氧化物酶体的形成5-10内质网中的前体膜--膜蛋白质插入膜中--基质蛋白质运输进入过氧化物酶体--分裂形成过氧化物酶体第六章细胞通讯（12学时）本章重点难点：各种细胞通讯的分子机理。一、细胞通讯的基本概念6-1细胞间的相互联系，也包括细胞内的通讯，它能引发靶细胞一系列的反应。（一）、细胞通讯的方式6-1书P2181.细胞间通道（通常是同类细胞间）胞间连丝缝隙连接2.细胞间直接的物理接触（信号分子参与）3.细胞间不接触，通过信号分子通讯内分泌式通讯、旁分泌式通讯、自分泌式通讯（二）、信号分子和受体6-1（三）、细胞通讯中其它保守的蛋白质功能6-21.G蛋白酶开关书p2332.连接蛋白质3.蛋白激酶和蛋白磷酸化酶4.通过O－连接的N－乙酰葡萄糖胺使蛋白质糖基化二、信号分子通过细胞膜受体通讯的机制6-3（一）、通过第二信使的作用6-41.cAMP作为第二信使书p2332.Ca2+作为第二信使6-63.1,2－甘油二酯和1,4,5－三磷酸肌醇作为第二信使6-84.cGMP和NO作为第二信使6-927 （1）膜鸟苷酸环化酶（2）细胞质鸟苷酸环化（二）、Gβγ的作用6-10（三）、作用于酪氨酸蛋白激酶系统1.激活受体酪氨酸蛋白激酶2.Ras在酪氨酸蛋白激酶体系中的作用（1）激活RasRas[GDP]鸟苷酸转换蛋白Ras[GTP]（2）Ras激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Ras[GTP]激活Raf，Raf激活蛋白激酶MEK，MEK激活MAPK蛋白激酶，MAPK进入细胞核调控转录因子活性。3.受体酪氨酸蛋白激酶的分解4.胰岛素受体和血糖浓度的调节6-12（四）、作用于酪氨酸蛋白激酶链接的受体6-12（五）、作用于整联蛋白（integrin）1.激活依赖于Ras的信号传导路径2.激活依赖于3-磷酸肌醇激酶（PI3K）的信号传导路径3.调控focaladhesion的组成（六）、蛋白激酶与细胞通讯（七）、引发基因活动改变瞬时表达与稳定表达4.激活调控含cAMP反应成分基因的转录因子某些基因具camp反应成分，这些基因的表达受转录因子CREB激活，CREB转录因子的活性受多条细胞通讯路径调控。6-175.激活调控c-fos基因的转录因子6-186.激活转录因子STATs干扰素γ，干扰素α27 （八）、受体的调节（1）细胞的内吞作用造成膜受体的数量减少（2）磷酸化作用调节膜受体的活性降低受体膜的活性。Β肾上腺激素能受体磷酸化后，camp合成受阻。Camp、1,2-甘油二脂和1,4,5-三磷酸肌醇作为第二信使的受体活性调节6-19一、G蛋白偶联受体（GPCR）细胞质膜上最多，也是最重要的信号转导系统是由G-蛋白介导的信号转导。这种信号转导系统有两个重要的特点:①系统由三个部分组成:7次跨膜的受体、G蛋白和效应物(酶);②产生第二信使。1.G蛋白的结构与功能G蛋白，即GTP结合蛋白(GTPbindingprotein)，参与细胞的多种生命活动,如细胞通讯、核糖体与内质网的结合、小泡运输、微管组装、蛋白质合成等。1)异源三体G蛋白(heterotrimericGprotein)的结构组成G蛋白偶联系统中的G蛋白是由三个不同亚基组成的异源三体,三个亚基分别是α、β、γ,总相对分子质量在100kDa左右。G蛋白有多种调节功能,包括Gs和Gi对腺苷酸环化酶的激活和抑制、对cGMP磷酸二酯酶的活性调节、对磷酯酶C的调节、对细胞内Ca2+浓度的调节等，此外还参与门控离子通道的调节。2)蛋白激酶A的细胞核功能:调节基因表达被cAMP激活的PKA,大多数在胞质溶胶中激活一些细胞质靶蛋白,也有少数被激活的PKA可以转移到细胞核中磷酸化某些重要的核蛋白,其中多数是被称为CREB(cAMPresponseelementbinding,cAMP效应元件结合因子)的转录因子3)G蛋白循环(Gproteincycle)在G蛋白偶联信号转导系统中，G蛋白能够以两种不同的状态结合在细胞质膜上。一种是静息状态，即三体状态;另一种是活性状态，G蛋白由非活性状态转变成活性状态，尔后又恢复到非活性状态的过程称为G蛋白循环G蛋白的这种活性转变与三种蛋白相关联:●GTPase激活蛋白GAPs●鸟苷交换因子，GEFs27 ●鸟苷解离抑制蛋白GDIsG蛋白与GDP结合时是非活性状态，如果无活性的G蛋白与GDI结合，则处于被抑制状态(无活性)，如果G蛋白与GEF相互作用，将GDP换成了GTP，G蛋白则被激活，可启动下游反应。处于活性状态的G蛋白与GTPase激活蛋白(GAP)相互作用，会激活GTPase，使GTP水解成GDP，此时的G蛋白又恢复到无活性状态。1)G蛋白的信号转导作用在G蛋白偶联受体的信号转导中G蛋白起重要作用，它能够将受体接受的信号传递给效应物，产生第二信使，进行信号转导，某些G蛋白可直接控制离子通道的通透性1.G蛋白偶联系统组成G蛋白偶联系统由三部分组成:表面受体、G蛋白和效应物,由于这三种复合物都是结合在膜上,故此将它们称为膜结合机器。●受体G蛋白偶联受体都是7次跨膜的膜整合蛋白，包括肾上腺素(β型)受体、胰高血糖素受体、促甲状腺素受体、后叶加压素受体、促黄体生长素受体、促卵泡激素受体等。●G蛋白●效应物(effector)所谓效应物是指直接产生效应的物质,通常是酶,如腺苷酸环化酶、磷酸脂酶等,它们是信号转导途径中的催化单位。2.第二信使:cAMP●腺苷酸环化酶(adenylatecyclase，AC)腺苷酸环化酶是膜整合蛋白，能够将ATP转变成cAMP，引起细胞的信号应答，故此，AC是G蛋白偶联系统中的效应物。■G蛋白偶联受体跨膜信号转导机理在G蛋白偶联系统中，G蛋白的作用主要是将信号从受体传递给效应物，它包括了三个主要的激发过程：●G蛋白被受体激活●G蛋白将信号向效应物转移●应答的终结当与Gα结合的GTP被水解成GDP时，信号转导就会终止。因此，27 GTP水解的速率在某种程度上决定着信号转导的强度和时间的长短。Gα亚基具有较弱的GTPase的活性，能够缓慢地水解GTP，进行自我失活.失活可通过与GAP的作用而加速。一旦GTP水解成GDP，Gα-GDP能够重新与Gβγ复合物恢复结合，形成非活性的三体复合物。■激活型和抑制型cAMP信号途径●组成和作用效果在某些细胞中，G蛋白不仅可激活酶活性（又称向上调节），也可抑制其作用的酶活性（向下调节)，因此有激活型和抑制型两种不同的系统。●毒素对G蛋白的核糖化作用霍乱弧菌感染人体后，产生一种毒素:霍乱毒素(choleratoxin，一种毒蛋白，具有催化作用，可将NAD+上的ADP-核糖基团转移到Gsα亚基上，使G蛋白核糖化，这样抑制了α亚基的GTPase活性，从而抑制了GTP的水解，使Gs一直处于激活状态。其结果使腺苷酸环化酶处于永久活性状态，cAMP的形成失去控制，引起Na+和水分泌到肠腔导致严重腹泄。百日咳则是由百日咳杆菌所引起，该菌产生的百日咳毒素同样使G蛋白的α亚基ADP核糖化。与霍乱毒素作用机理不同的是，百日咳毒素使Gi蛋白α亚基进行ADP核糖化，阻止了Gi蛋白α亚基上的GDP被GTP取代，使其失去对腺苷酸环化酶的抑制作用，其结果也是使cAMP的浓度增加。由于百日咳是经呼吸道感染的，被感染的细胞与呼吸系统相关，这些细胞中cAMP浓度的提高，促使大量的体液分泌进入肺，引起严重的咳嗽。1.PKA系统(proteinkinaseAsystem，PKA)的信号转导机理■蛋白激酶A与底物磷酸化●蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)又称为依赖于cAMP的蛋白激酶A，是由四个亚基组成的四聚体。一般认为，真核细胞内几乎所有的cAMP的作用都是通过活化PKA，从而使其底物蛋白发生磷酸化而实现的。cAMP与PKA的调节亚基结合，使PKA的调节亚基与催化亚基分开，被激活的催化亚基可使底物磷酸化。●磷酸化与去磷酸化27 磷酸化和去磷酸化是信号转导中最简便而又十分快捷的反应方式,一般是通过磷酸化而激活,去磷酸化而失活,磷酸成为蛋白(酶)的活性标记。■蛋白激酶A的细胞质功能与细胞核功能●蛋白激酶A被cAMP激活后能够使多种底物磷酸化，引起多种反应。●PKA既可直接修饰细胞质中的底物蛋白，使之磷酸化后立即起作用，也可以进入细胞核作用于基因表达的调控蛋白启动基因的表达。●蛋白激酶A的细胞质功能:糖原分解在脊椎动物中,糖原的分解受一些激素的控制,如肾上腺素和胰高血糖素中的任何一种激素同细胞膜受体结合,都会激活磷酸化酶,使糖原分解成1-磷酸葡萄糖,然后进一步分解为6-磷酸葡萄糖、葡萄糖后进入血液。●蛋白激酶A的细胞核功能:调节基因表达被cAMP激活的PKA,大多数在胞质溶胶中激活一些细胞质靶蛋白,也有少数被激活的PKA可以转移到细胞核中磷酸化某些重要的核蛋白,其中多数是被称为CREB(cAMPresponseelementbinding,cAMP效应元件结合因子)的转录因子。■cAMP信号的终止该途径的信号解除有两种方式:●通过cAMP磷酸二酯酶(cAMPphosphodiesterase,PDE)将cAMP的环破坏,形成5＇-AMP。●通过抑制型的信号作用于Ri,然后通过Gi起作用。Gi蛋白被激活后，GTP同Gi蛋白的α亚基结合，Gi的α亚基与Giβγ复合物分离，并在细胞膜的胞质面进行扩散；当Gi的α亚基与腺苷酸环化酶结合后则抑制其活性；而Giβγ复合物则可同激活型的Gsα作用，阻止它去激活腺苷酸环化酶。1.PKC系统(proteinkinaseCsystem)在这一信号转导途径中，膜受体与其相应的第一信使分子结合后，激活膜上的Gq蛋白(一种G蛋白)，然后由Gq蛋白激活磷酸酯酶Cβ(phospholipaseCβ，PLC)，将膜上的脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidylinositolbiphosphate，PIP2)分解为两个细胞内的第二信使:DAG和IP3，最后通过激活蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)，引起级联反应，进行细胞的应答。该通路也称IP3、DAG、Ca2+信号通路。■系统组成与信号分子27 ●系统组成由三个成员组成:受体、G蛋白和效应物。Gq蛋白也是异源三体,其α亚基上具有GTP/GDP结合位点,作用方式与cAMP系统中的G蛋白完全相同。该系统的效应物是磷酸肌醇特异的磷脂酶C-β(phosphatidylinositol-specificphospholipaseC-β,PI-PLCβ),此处的β表示一种异构体。●信号分子与该系统受体结合的信号分子有各种激素、神经递质和一些局部介质。■第二信使的产生该途径有有三个第二信使:IP3、DAG、Ca2+。产生过程包括磷脂酶C的激活、IP3/DAG的生成、Ca2+的释放。●磷脂酶C-β的激活磷脂酶C-β相当于cAMP系统中的腺苷酸环化酶,也是膜整合蛋白,它的活性受Gq蛋白调节。当信号分子识别并同受体结合后，激活Gq蛋白的亚基。激活的Gq-α亚基通过扩散与磷脂酶C-β接触，并将磷脂酶C-β激活。●第二信使IP3/DAG的生成被激活的磷脂酶C-β水解质膜上的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，产生三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(，DAG)。●IP3启动第二信使Ca2+的释放由PIP2水解后产生的IP3是水溶性的小分子，它可以离开质膜并迅速在胞质溶胶中扩散。IP3同内质网膜上专一的IP3受体(IP3receptor)结合，使IP3-门控Ca2+通道打开，使Ca2+从内质网中释放出来。■蛋白激酶C的激活蛋白激酶C的激活涉及一系列复杂的反应过程，是三种第二信使共同作用的结果。一、离子通道偶联受体27 具有离子通道作用的细胞质膜受体称为离子通道受体。这种受体见于可兴奋细胞间的突触信号传导，产生一种电效应，如烟碱样乙酰胆碱受体(nAchR)、γ-氨基丁酸受体(GABAR)和甘氨酸受体等都是离子通道偶联受体。它们多为数个亚基组成的寡聚体蛋白,除有配体结合位点外,本身就是离子通道的一部分,并借此将信号传递至细胞内。信号分子同离子通道受体结合,可改变膜的离子通透性。　　递质门控通道或亲离子型受体，多亚基组成的受体-离子通道复合体，存在于神经细胞和其他可兴奋细胞间的突触信号传递，神经递质通过与受体的结合而改变通道蛋白的构型，导致离子通道的开或关，改变细胞膜的离子通透性，把胞外化学信号转换为电信号。一、酪氨酸激酶受体p245由细胞外、跨膜及细胞内三部分组成，细胞外侧与配体结合，由此接受外部信息，与之相连的是一段跨膜结构，细胞内侧为酪氨酸激酶活性区域，能促进自身酪氨酸残基的磷酸化而增强此酶活性，再催化细胞内各种底物蛋白磷酸化，激活胞内蛋白激酶，从而将细胞内信息传递到细胞内，如胰岛素受体等。二、膜表面受体及跨膜信号小结：1、离子通道型受体及其信号传导途径该类受体的共同特点是由多亚基组成受体/离子通道复合体，除本身有信号接受部位外，又是离子通道，其跨膜信号转导无需中间步骤，反应快。（1）配体依赖性受体/离子通道：烟碱型乙酰胆碱受体（nAchR）（2）电压依赖型受体/离子通道2、G蛋白偶联型受体及其介导的信号传导系统到达膜表面的外来化学信号作用于相应的靶细胞时，能与膜表面的受体蛋白质作特异性结合，该受体分子中第7个跨膜螺旋能够识别、结合某种特定外来化学信号。在受体因结合了特异化学信号而激活时，将进而作用于膜中的G-蛋白质。G-蛋白通常由α-、β-、和γ-3个亚单位组成；α-亚单位通常起催化亚单位的作用，当G-蛋白未被激活时，它结合了一分子的GDP（二磷酸鸟苷）；当G-蛋白与激活了的受体蛋白在膜中相遇时，α-亚单位与GDP分离而又与一分子的GTP（三磷酸鸟苷）结合，这时α-亚单位同其他两个亚单位分离，并对膜结构中（位置靠近膜的内侧面）的第三类称为膜的效应器酶的蛋白质起作用，后者的激活（或被抑制）可以引致胞浆中第二信使物质的生成增加（或减少）,如ATP——>cAMP。由于第二信使物质的生成经过多级催化作用，少数几个膜外化学信号分子同受体的结合，就可能在胞浆中生成数目众多的第二信使分子，这是这种类型的跨膜信号传递的重要特点之一。而第二信使相应作用的靶分子主要为各种蛋白激酶，从而调节各种生理过程。3、具有酶活性的受体及其信号传导途径27 受体本身是一种具有跨膜结构的酶蛋白，其胞外域与配体结合而被激活，通过胞内侧激酶反应将胞外信号传至胞内。这类分子一般分为3个结构区，即细胞外与配体的结合区，细胞内部具有激酶活性的结构区和连接此两个部分的跨膜结构区。使之既具有受体的功能，又具有把胞外信号直接转化成胞内效应的能力，是一种新颖的细胞信号过膜传递方式。一、信号分子通过细胞内受体的作用机制激素反应成分HRE（顺式调控元件），结构，特点，不同受体所处状态不同，与HRE结合后调控结果不同。6-19二、微生物中由激素引发的细胞通讯（一）外激素引起酵母细胞交配两个单倍体酵母细胞的交配依赖于外激素引发的细胞间通讯6-21（二）特异性的信号传导路径复合体蛋白质复合体讲参与不同信号传导的同种的蛋白分开（三）细胞分化过程中的细胞聚集依赖于细胞间通讯外激素周期性分泌6-2227