科研计划书-15d-pgj2抑制单核噬细胞株的生物活性及作用机制的探讨

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　张媛媛122011000038科研计划书项目名称:15d-PGJ2抑制单核/巨噬细胞株的生物活性及作用机制的探讨研究类型：联合攻关（）重点支持（√）自主创新与普及推广（）项目范围：指南项目（）招标项目（）常规项目（√）青年项目（）申请者：张媛媛申请单位：基础医学院单位归属：首都医科大学通讯地址：北京市丰台区右安门外西头条10号首都医科大学邮政编码：100069单位电话：010-83950102电子邮箱：liuyuexi.love@sina.com 基本信息：项目信息中文题目15d-PGJ2抑制单核/巨噬细胞株的生物活性及作用机制的探讨英文题目学科1细胞生物学学科2分子生物学申请经费XX万元起止年月2012．1—2014．12申请者信息姓名张媛媛性别女出生年月民族汉学位硕士在读职称职务身份证号主要研究领域肝纤维化研究电话手机号码电子邮箱合作单位信息单位名称代码首都医科大学基础医学院项目摘要（限400字）：肝纤维化是多种病因所致的慢性肝病共有的病理过程，其主要病理特征是以胶原为主的细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）在肝脏内的过量沉积。肝脏肌成纤维细胞（hepaticmyofibroblasts,hMF）是合成和分泌ECM的主要细胞，在肝纤维化发生过程中起着决定性的作用。最近，骨髓来源的肌成纤维细胞颇受关注，然而对于它们在体内的迁移机制却知之甚少。鞘磷脂的代谢中间产物——磷酸鞘胺醇（sphingosine1-phosphate,S1P）作为细胞迁移的重要调节器，发挥着重要的生物学功能。本研究结合体内和体外实验，旨在证实在肝纤维化发生过程中骨髓间充质干细胞可向肝脏迁移分化为hMF，并以S1P为靶分子，探讨其介导骨髓间充质干细胞向受损肝脏归巢的作用。ICR小鼠经射线照射后通过尾静脉移植带有绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）的全骨髓细胞或骨髓间充质干细胞，4周完成骨髓重建后分别以CCl4和BDL制成肝纤维化模型。在1天、3天、2周、4周和6周时处死小鼠，取肝组织应用免疫荧光染色的方法鉴定并统计骨髓来源的hMF。同时，用高效液相色谱的方法测定纤维化肝组织和血清中S1P的含量，用Westernblot和real-time RT-PCR的方法分别检测与S1P代谢相关酶的蛋白和mRNA水平，以及肝组织中S1P特异受体的表达变化。体外实验：应用BoydenChamber培养方法检测S1P对骨髓间充质干细胞迁移的作用。同时，采用S1P受体拮抗剂预处理细胞，鉴定参与S1P介导骨髓间充质干细胞迁移的受体类型。1．骨髓间充质干细胞在肝纤维化模型小鼠体内可迁移至肝脏，并在受损的肝组织内分化为hMF；2．纤维化肝组织和血清中S1P的含量显著增加，而骨髓中S1P的含量无明显变化。此外，纤维化肝组织中与S1P代谢相关的鞘胺醇激酶1（sphingosinekinase1,SphK1）mRNA表达上调，其活性也增强，S1P磷酸水解酶（S1Pphosphatase）以及裂解酶（S1PlyasemRNA）没有明显变化；3．S1P在体外明显刺激了骨髓间充质干细胞的迁移，呈剂量依赖性，受体S1P3参与了这一过程；4．体内实验中，受体S1P3的拮抗剂——Suramin明显抑制了骨髓细胞向受损肝脏的归巢；5．转化生长因子b1（TGF-b1）在体外能诱导骨髓间充质干细胞向hMF分化。结论：S1P/S1P3信号介导了骨髓间充质干细胞向受损肝脏的归巢，参与了肝纤维化的发生过程，提示S1P可以作为肝纤维化的一个生物标记物，以S1P/S1P3信号为作用靶点将有望设计出新的抗纤维化药物。关键词（用分号分开，不超过5个）肝纤维化；骨髓间充质干细胞；磷酸鞘胺醇；骨髓移植；细胞迁移；细胞分化；绿色荧光蛋白 二、项目组成员姓名性别年龄学位研究方向单位XX男25硕士在读肝纤维化研究首都医科大学XXX女23硕士在读肝纤维化研究首都医科大学三、立题依据(一)研究现状肝纤维化是多种病因所致的慢性肝病共有的病理过程，涉及到细胞、细胞因子和细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）之间一系列复杂的变化，其主要特征是以胶原为主的细胞外基质在肝脏内的过量沉积。进一步发展可引起肝小叶结构改建、假小叶及结节形成，即肝硬化。慢性肝病的病因包括病毒性肝炎、慢性酒精中毒、慢性胆汁瘀积、化学毒物或药物、肝脏淤血、遗传和代谢疾病以及血吸虫的感染等，所有这些病因均可导致肝细胞炎症及损伤，使肝细胞呈弥漫变性、坏死，继而坏死区胶原纤维增生。大量研究证实，肝脏肌成纤维细胞（hepaticmyofibroblasts,hMF）是合成和分泌细胞外基质的主要细胞，在肝纤维化发生过程中起着决定性的作用。它们在肝细胞坏死部位增殖，分泌炎症细胞因子和趋化因子，合成大量基质蛋白（如：I型胶原，III型胶原等）和基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）等，因而导致肝纤维化[1-3]。近年来，关于肌成纤维细胞的来源问题成为国内外研究的热点。原因在于，探明了肌成纤维细胞的来源，对其分化进行可控性调节，就有可能从源头上解决肝纤维化这一难题，从而为这一难治性疾病的防治提供新的线索。多数学者认为肝脏肌成纤维细胞是由肝星状细胞活化而成[4]。在正常肝组织中，肝星状细胞约占肝脏细胞总数的5~10%，位于窦周Disse间隙。急性或慢性肝损伤时，肝星状细胞被激活，转化成肌成纤维细胞，表达平滑肌肌动蛋白a（smoothmusclea-actin,a-SMA）。也有学者认为肝脏肌成纤维细胞来源于汇管区和中心静脉区的成纤维细胞，其研究发现在实验性导管源性肝硬变的发生过程中，这些成纤维细胞转化成表达a-SMA的肌成纤维细胞，是肝硬变发生过程中的决定因素[5]。然而，肝星状细胞和成纤维细胞均为肝组织固有细胞，由于其细胞表面没有特殊的识别标志，因此很难在体内以这样的细胞为靶点设计出有效的抗肝纤维化方案。最近大量研究表明，肝脏肌成纤维细胞有可能存在第三种来源——骨髓（bonemarrow, BM），并认为它们主要来源于骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）[6-10]。由此说明，当肝脏受损伤以后，骨髓干细胞可以迁移到受损的肝脏并分化为肌成纤维细胞从而参与肝纤维化。然而，骨髓细胞是如何迁移到受损的肝组织并参与肝纤维化的发生？哪些生物活性分子在这一过程起主要作用？这些问题尚需进一步研究。很显然，阐明了这一机制将有助于我们制定新的特异的抗纤维化治疗方案。研究发现，膜磷脂的代谢产物在细胞正常的生命活动中起着举足轻重的作用，如三磷酸肌醇（IP3）、二脂酰甘油（DAG）等就是重要的第二信使。磷酸鞘胺醇（sphingosine1-phosphate,S1P）是新近发现具有重要生理功能的另一种膜磷脂代谢产物，它在细胞增殖、存活、迁移、分化以及免疫功能的调节等方面都有着极其重要的作用[11-15]。S1P是鞘磷脂的一个中间代谢产物，体内调节S1P合成的主要相关酶有：催化鞘胺醇磷酸化生成S1P的鞘胺醇激酶（sphingosinekinase1and2,SphK1,SphK2）；促进S1P降解的S1P磷酸酶（S1Pphosphatase）和裂解酶（S1Plyase）[15]。研究证实，S1P既可以作为细胞内第二信使发挥作用，又可以与细胞表面的特定受体结合而发挥重要的生物学功能[11]。由于S1P作为胞内第二信使的作用靶点目前还不清楚，因此相关报道较少；而S1P作为胞外配体的研究较多，它可与其相应受体结合后激活或抑制多种信号通路从而发挥不同的生物学效应。S1P受体家族最早被命名为内皮细胞分化基因（endothelialdifferentiationgene,EDG）受体，属于G蛋白偶联受体家族。现已发现这类Edg受体家族有5个成员：EDG1、EDG5、EDG3、EDG6和EDG8（现已分别改称为S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5）[16]。目前对于S1P研究比较多的一个方面是促进细胞迁移的作用[17]，而且有研究表明S1P在体外明显刺激了骨髓干细胞的迁移[18]。由此，我们提出了如下假说：当肝脏受损伤后，肝组织中S1P含量上升，从而介导骨髓细胞向受损肝脏归巢并分化为肌成纤维细胞参与纤维化。本研究拟结合体外和体内实验，应用两种经典肝纤维化模型——四氯化碳（CCl4）模型和胆管结扎（BDL）模型，首先证实肝脏受损以后骨髓细胞是否参与了肝纤维化的发生，继而以S1P为靶分子，探讨其是否参与了肝纤维化，以及它在骨髓细胞向受损肝脏迁移并分化为肌成纤维细胞过程中的作用机制，从一较新的视角探讨骨髓细胞在肝纤维化发生过程中的作用。对这一过程的深入研究将有助于我们更深入地了解肝纤维化的发生机制，从而设计出新的抗纤维化治疗方案。图2磁酶免化学发光分析原理图（摘自参考文献26）用磁微粒化学发光法检测癌胚抗原的优点如下：1.与单克隆抗体结合反应特异性高，重复性好；2. 碱性磷酸酶显色结果稳定，不含致癌物；3.酶标记单克隆抗体特异性强，无放射污染和危害；4.磁性抗体分离技术，不用离心，不用液相；5.反应灵敏、准确、检测速度快，与临床符合率较高，为临床提供了较为可靠的诊断依据[18]。本论文将化学发光磁酶免疫法用于肿瘤标志物的检测中。肿瘤标志物（Tμmormarker，TM）作为诊断肿瘤的重要指标，体内TM含量的变化可以为临床医生提供很多信息，从而指导他们及早地发现肿瘤，更合理的为患者提供治疗措施[19]。但体液中肿瘤标志物的含量通常非常的低，一般的检测方法很难对其进行准确的检测。本论文通过制备磁微粒化学发光酶免疫分析试剂盒对血清中的癌胚抗原CEA进行检测，实验中制备了试剂盒的各组分，对抗体与磁微粒的配比，反应温度、反应时间进行了优化。对比了国产和进口磁微粒分别与抗体连接的效果，最后用优化后的试剂盒来检测临床血清并对该试剂盒的热稳定性进行了评价。临床CEA血清检测结果不但能满足临床分析检测的需求，而且可以节省成本。实验技术路线（见图3），磁微粒化学发光法是一种很有前景的分析检测方法，此方法在肿瘤标志物检测中的应用与推广必将使肿瘤早期诊断成为可能，从而推动人类尽早攻克肿瘤[20]。(二)拟解决的问题：⑴检测磁微粒在胚癌基因和正常原胚组织中的表达并比较其不同⑵检测胚癌基因不同手术病理分期患者原胚组织中磁微粒的表达情况主要参考文献：[1]张丽明．化学发光标记及发光免疫分析[J]．基础医学与临床，1995，15（4）：234-247．[2]宇传华．诊断医学统计学[M]．北京:人民卫生出版社，2005：13-19．[3]BaeyensWR，SchulmanSG，CalokerinosACetal．Chemiluminesce-baseddetection：principlesandanalyticalapplicationsinflowingstreamsandinimmunoassays[J]．J．Pharm．Biomed．Anal，1998，17(6~7)：941~953．[4]林金明．化学发光基础理论与应用[M]．北京：化学工业出版社，2004:1-28．[5]王自正．现代医学标记免疫学[M]．北京：人民军医出版社，2000：7-26．[6]WangJ，DaX，HeYH，etal．Localizationoftumorbychemiluminescenceprobeduringphotosensitizationaction[J]，CancerLetters．2002，188：59-65．[7]张忠英，高惠川，林永志等．电化学发光免疫分析技术联合检测CYFRA21-l和癌胚抗原对肺癌的诊断意义[J]，福建医科大学学报，2001，35(2)：169-171．[8]XueMD，HaruyamaT，KobatakeE，etal．Electrochemicalluminescenceimmunosensorforfetoprotein[J]．SensActuatorsB，1996，36：458-462．[9]林日文，吴潭梅．TSH、T3、T4磁分离酶联免疫法测定1000例结果评价[J]．中国保健杂志，2006，14(12)：68-72．[10]李宣海，巫向前，倪语星．肿瘤标志物的检测与临床[M]．北京：人民卫生出版社，1997：69~167．[11]俞信祥，顾静欣，陆卫国等．HCG-β放射免疫快速测定及102例结果分析[J]．上海医学检验杂志，1995，10(3)：163．[12]庄惠生，王琼娥，陈国南等．测定癌胚抗原的化学发光免疫分析新方法[J]．光谱学与光谱分析，2000，20(6)：889-891． 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五、研究方案 2.1细胞株的传代培养：1)在无菌条件下用DMEM（10%FBS）培养基，5%CO2进行培养。当细胞密度至90%以上汇合时，进行消化传代。2)细胞弃去培养液，用PBS培养液冲洗贴壁细胞层2次，加入含10%FCS的DMEM培养液，用细胞刮将细胞刮下来。3)细胞计数后按一定比例传代。2.5细胞免疫荧光染色将细胞放于倒置显微镜下用不同的放大倍数进行观察，从形态学的层面对细胞进行鉴定。原理：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光，可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。细胞准备与固定：按1×105细胞/孔的密度，将细胞接种到预先放置盖玻片的小皿中，置CO2培养箱培养过夜，待细胞上贴壁生长并具有一定的密度时进行如下操作1)用PBS洗3×5min；2)含0.5%TritonX-100的PBS，室温打孔15min；3)用PBS洗3×5min；4)用2%BSA封闭，37℃，30min；5)加一抗（anti-PPARγ,SantaCruzBiotechnology,CA,USA，1:50）室温1-2h；6)用PBS洗3×5min；7)加荧光二抗（JacksonImmunoresearch,WestGrove,PA,USA,1:1000），室温1h；8)用PBS洗3×5min；9)用封片剂封片；10)荧光显微镜或共聚焦显微镜观察，拍片。2.7肝组织和血清中S1P水平检测：高效液相色谱法(high-performanceliquidchromatography,HPLC)1)取100ml血清或肝组织匀浆液（25mMHCl/1MNaCl）加入250mlMeOH和0.6ml浓盐酸； 2)冰水中超声10min；3)加入500mlCHCl3/1MNaCl(1:1，v/v)和25ml3NNaOH；4)vortex，30sec×2；10000rpm，3min，4℃；5)取上层水相至5ml玻璃管中；6)下层有机相加入250mlMeOH/1MNaCl(1:1，v/v)和13mlNaOH，vortex,30sec×2；10000rpm，3min，4℃，取上层水相与前合并；7)重复第6步；8)加入150mlreactionbuffer(200mMTris–HCl,75mMMgCl2in2Mglycinebuffer,pH9.0)，50UApase，vortex；9)加入200mlCHCl3到上述混合物底层，封口；10)37℃水浴孵育1h；11)加入17ml浓盐酸终止反应；12)加入500mlCHCl3，vortex，2000rpm，5min，4℃，吸取下层CHCl3相到新的玻璃管中；上层水相再加入500mlCHCl3，vortex，2000rpm，5min，4℃，吸取下层CHCl3相与前合并；13)CHCl3相加入alkalinewater（500ml）洗3次（2000rpm,3min,4℃）；14)CHCl3相转入新的玻璃管中，冷冻干燥；15)Thedriedlipidresidue加入250ml无水乙醇，封口后在67℃水浴孵浴25min；16)加入30mlOPAreagent[50mgOPA,1mlethanol,100ml2-mercaptoethanol,and50ml3%(w/v)boricacidsolutionadjustedtopH10.5]，室温孵浴20min；17)HPLC-analysis:进样量：60ml柱温：20oC流速：1ml/min流动相：乙腈/水＝90：10激发波长（Ex）：340nm发射波长（Em）：455nm2.8鞘胺醇激酶活性(SphKactivity)检测2.8.1含鞘胺醇激酶的肝组织总蛋白提取：1)取少许肝组织，生理盐水漂洗，滤纸吸干，取肝组织块（100-200mg），放入1.5mlEP管，加入500mlBufferA。2)冰上匀浆，4sec/次，大约10次左右。3)冰上超声裂解（最小频率）2min。 4)将匀浆液在4℃下最大转速21,000g离心3min，取上清液转移至新EP管中，21,000g继续离心2h，取上清液备用。5)取待测样品2ml加高压灭菌去离子水98ml，将样品稀释50倍后BCA法测定浓度（见2.12.2）。溶液配置(BufferA):1MTris(PH7.4)1ml40mMEDTA1.25mlGlycerol10ml100mMNaF7.5ml100mM钒酸钠0.5ml100mMPMSF0.5ml1Mb-磷酸甘油2mlb-巯基乙醇3.5mlLeupeptine2mg/mlAprotinine2mg/ml50mM脱氧维生素B0.5mlH2O26.75ml2.8.2酶促反应：取100mg蛋白提取物和10ml1mmol/L鞘胺醇（溶解于5%TritonX-100）混匀，加入5ml[γ-32P]ATP(10mCi,20mmol/L,MgCl2200mmol/L)，37oC反应30min。2.8.3终止反应：向反应体系中分别加入10ml1mol/LHCl和0.4ml氯仿/甲醇/HCl(100:200:1,v/v)混合物，猛烈振荡，终止反应。2.8.4有机抽提和薄层层析：各反应管加入120ml氯仿和120ml2mol/LKCl，吹打混匀，于12,000g离心5min。此时水相和有机相分离，弃去水相，样品各取20ml有机相点样于硅胶GelG60，于层析液（正丁醇、乙醇、乙酸和水按80∶20∶10∶20混匀，v/v）中展开；放射自显影，用图像分析软件分析光密度。2.9细胞迁移实验1)骨髓间充质干细胞汇合度达到80－90%后，PBS冲洗一次，更换无血清培养基培养24h。2)胰蛋白酶消化、离心后，用无血清培养基悬浮细胞，以4×104/孔的细胞密度（体积为200 ml）接种到24孔transwell小室中，小室下层加入700ml无血清培养基，同时向下层加入S1P、H2S1P（溶解于0.4%BSA）诱导细胞的迁移，以0.4%BSA作为阴性对照。当观察S1P3受体拮抗剂suramin是否能抑制S1P诱导的骨髓间充质干细胞迁移时，在接种到transwell小室之前先加入suramin处理细胞1h。3)37oC、5%CO2培养4h后用冰冷的甲醇固定15min，用PBS冲洗3次，同时用棉签擦去上层贴附的细胞。4)苏木素染色30min，PBS冲洗3次。5)显微镜下观察并拍照，每孔随机选择6个视野，每个实验条件设置3个平行孔，每次实验重复3次。2.10细胞分化实验骨髓间充质干细胞汇合度达到80－90%后，PBS冲洗一次，更换无血清培养基培养24h，然后加入1000nMS1P或10ng/mlTGF-b1，同时设置对照组，分别刺激细胞6、12、24h后收集细胞，提取总RNA进行real-timeRT-PCR，检测a-SMA、I型和III型胶原的mRNA水平。2.7实时荧光定量聚合酶链反应(Real-timeRT-PCR)2.7.1总RNA的提取和定量（使用QIAGEN®RNeasyMiniKit）：1)取60-100mg肝组织加入600mlRLT裂解液，置于冰上匀浆；2)1ml/2ml注射器反复抽吸使组织完全裂解，13200rpm离心3min；3)取上清入另一EP管；4)加入70%乙醇，上下混匀后取600μl混合液加入RNeasymini柱，室温下13200rpm离心1min；5)向柱内加入350mlRW1缓冲液，室温下13200rpm离心1min,；6)重复第（5）步操作；7)将mini柱放入一新的收集管，加入500mlRPE，13200rpm，离心1min，弃离出液；8)再加入500mlRPE液，13200rpm,离心2min，弃离出液；9)将mini柱放入一新的收集管中，13200rpm,离心1min；10)将mini柱放入超净台自然晾干（15min），然后放入新的EP管中，加入30mlRNase-free水。室温放置10min,13200rpm离心1min,作定量或置-80℃贮存。11)RNA定量：4mlRNA+396mlTris-HCL溶液，紫外分光光度计测定OD260和OD280吸光值，按下列公式计算RNA含量：RNA浓度（mg/ml）=（OD260×40×稀释倍数）/1000。选择OD280/OD260值为1.9-2.1之间的样品。 2.7.2RNA甲醛凝胶电泳1)溶液配制①缓冲液的配制：10×FA胶缓冲液（母液）pH7.0：200mM3-[N-morpholino]propanesulfonicacid(MOPS)50mMsodiumacetate（乙酸钠）10mMEDTA即：100（500）ml10×FA胶缓冲液（母液）：4.1860（20.930）gMOPS0.6804（3.402）g醋酸钠（乙酸钠）0.3722（1.861）gEDTA加入96（480）ml蒸馏水，用NaOH调pH到7.0，定容，高压灭菌。1×FA胶缓冲液（工作液）：100ml10×FA胶缓冲液20ml37%甲醛880ml蒸馏水②1.2%FA胶制备：琼脂糖1.2gl0×FA胶缓冲液10ml蒸馏水74ml微波加热煮沸，使完全溶解，室温放置10min，冷却至65℃左右，于通风橱中加入EB（10mg/ml）1ml37%甲醛16m1混匀后灌胶。胶在使用前，需在1×FA胶缓冲液（即：电泳液）中平衡至少30min。③上样缓冲液的配制：5×RNA上样缓冲液：饱和的溴酚蓝水溶液16ml500mMEDTA，pH8.080ml37%（12.3M）甲醛720ml100%甘油2ml 甲酰胺3084mll0×FA胶缓冲液4ml加Rnase-free的水到10ml2)样品处理:5×RNA上样缓冲液1.0mlRNA样品4.0ml混匀后65℃温浴5min，使RNA变性，放于冰上降温后上样。3)电泳：80V电泳，1h后观察所提RNA的质量。2.7.3逆转录反应（RT）（使用M-MLV逆转录试剂盒）1)在200ml薄壁管中加入总RNA2.0mg01igo(dT)150.5mll0mMdNTPl.0mlH2O(10.5－总RNA体积)ml总体积12.0m12)在65℃加热5min，立即转入冰浴中至少3-5min;3)短暂离心后，加入:5×第一链缓冲液4.0m10.lMDTT2.0mlM-MLVl.0mlRnaseOUT(40U/ml)l.0ml总体积8.0m14)轻轻混匀，短暂离心,37℃50min,70℃l5min终止反应，置冰浴5min;（不加逆转录酶作为阴性对照）5)产物可以进行PCR反应或者-20℃储存。2.11.4Real-timePCR1)所用引物序列：引物序列 .GeneTypeSequence（5′－3′）TNFαMCP-1TGFβ1IL-6PPARγ18SrRNAF:GGCAGGTTCTGTCCCTTTR:CTGTGCTCATGGTGTCTTTTCTGF:TCTGGGCCTGCTGTTCACAR:GGACCCTTTGTATCAAGTGGCAF:TGCGCTTGCAGAGATTAAAAR:CTGCCGTACAACTCCAGTGAF:CTCTGGGAAATCGTGGAAATGR:AAGTGCATCATCGTTGTTCATACAF:GCCCACCAACTTCGGAATCR:TGCGAGTGGTCTTCCATCACF:GTAACCCGTTGAACCCCATTR:CCATCCAATCGGTAGTAGCGSYBRGreen法反应体系：H2O8mlPrimer-F(10mM)0.5mlPrimer-R(10mM)0.5ml cDNA1mlPowerSYBRGreenmastermix(2×)10ml共计20ml2)所用探针：procollagena1(I):MA00801666;procollagena1(III):MA00802331;a-SMA:MA00725412;SphK1:MA00448841;S1Pphosphatase:MA00473016;S1Plyase:MA00486079探针法反应体系：TaqMan®UniversalPCRMasterMix,NoAmpErateUNG(2×)10m120×Assay-on-DemandTMGeneExpressionAssayMix1m1cDNA1m1H2O8m1总体积20m1将检测的临界点设定在PCR扩增过程中,荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数(Ct)作为模板初始浓度的间接指标,溶解曲线分析采用默认条件。结果以18SrRNA进行校正,用ΔΔCt法计算相对基因表达。2.12蛋白印迹实验(WesternBlot)2.12.1肝组织总蛋白的提取6)取少许肝组织，生理盐水漂洗，滤纸吸干，取肝组织块（小于50mg/块），放入1.5mlEppendorf管，加入200ml细胞裂解液。7)冰上匀浆，4sec/次，大约10次左右。8)将匀浆液在4℃下16000rpm离心10min，取上清液备用。9)取待测样品2ml加高压灭菌去离子水98ml，将样品稀释50倍后测定浓度。2.12.2蛋白浓度测定按BCA蛋白检测试剂盒中的方法进行。1)制备牛血清白蛋白(BSA)标准样品和待测样品。标准品浓度梯度如下：标本加去离子水（ml）母液（ml）BSA终浓度（ml/ml）A0300原液2000B125375原液1500C325325原液1000 D175B液175750E325C液325500F325E液325250G325F液325125H400G液10025I400002)制备蛋白测定工作液：将试剂盒中的A液与B液按50:1混合。3)将蛋白标准品及样品各50ml与BCA工作液200ml混匀，37℃水浴30min，后置于冰中，终止反应。4)用酶标仪读取上述混合液在560nm处的吸光值。5)根据标准样品所测光密度值与相应的蛋白浓度制成蛋白标准含量曲线，通过标准曲线计算待测标本的蛋白浓度。2.12.3聚丙稀酰胺凝胶电泳配制聚丙烯酰胺凝胶（5%浓缩胶和12%分离胶），将制备好的凝胶固定于电泳装置上。电泳槽中加入Tris甘氨酸电泳缓冲液，50mg待测样品与上样缓冲液共25ml混匀后，99℃加热10min使蛋白变性。然后按顺序加待测样品及预染蛋白标准品上样，120V恒压电泳约1h。2.12.4膜转印取出凝胶，剪取与胶相同大小的硝酸纤维素膜1张和6张滤纸，并用转移液预先浸透。按照3层滤纸-硝酸纤维素膜-凝胶-纤维素膜和三层滤纸的次序铺在电转仪的正极上。清除当中的气泡。合并转移槽。将转移槽两极插上电极，150mA，转膜1h。2.12.5杂交1)取下转移后的硝酸纤维素膜，用TBST在摇床冲洗5min×3次，滤纸吸干表面。2)5%封闭液（1.25g脱脂奶粉+25mlTBST配制）室温封闭1h，以防止抗体的非特异性结合。3)封闭结束后，将硝酸纤维膜放入一抗液中（兔抗鼠抗S1P3抗体，1：500稀释），摇床上4℃过夜。4)TBST冲洗10min×3次，加入二抗（辣根过氧化物酶标记抗IgG抗体，1:10000稀释），室温孵育1h后，TBS-T冲洗10min×3次冲洗，进行化学发光显色。2.12.6化学发光取WesternblotLuminolregent中等量化学发光试剂A和B 混合，置于硝酸纤维素膜正面上反应5min，吸干混合液，暗室曝光，显影和定影，冲洗胶片。标本中内参照GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶Glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase,分子量37kDa）的测定采用相同步骤。2.12.7蛋白质含量分析将胶片扫描成图像文件后，用Gel-Doc凝胶成像系统计算单位光密度值和条带面积，将各实验点的总光密度值与内参照GAPDH比较，得到相对百分数。实验重复三次，最终结果以均值±标准误表示。2.13统计学分析所有实验数据以均值±标准误表示，采用SPSS11.5统计软件对实验结果进行分析，两组间比较采用tudent’st检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05认为有显著性差异。 六、可行性分析（包括对研究基础、工作条件、政策法律法规等方面进行分析）（1）项目的立项依据充分。本研究在前期工作中已经发现了磁微粒在其他肿瘤组织中的表达，国内外其他研究者也已经发现了磁微粒在其他肿瘤浸润性转移中的作用，这些都有利于本研究的借鉴和开展，进而分析这两个因子在肿瘤发生发展中过程中的相关性。（2）本研究拟采用的技术方法是目前分子生物学领域很成熟的技术方法，有利于本课题的进一步开展。（3）本研究的的负责人XX教授不仅有多年的临床一线工作经验，而且有很丰富的科研工作经验，曾发表学术论文二十余篇，参与专著编写两部。（4）本研究依托于北京市首都医科大学附属临床医院医院，这是一所集临床、科研、教学为一体的三级甲等综合性医院。附属临床医院可以保证有足够的标本来源，病理科有经验丰富的病理医师以保证标本病理诊断的准确性。另外，挂靠于首都医科大学附属临床医院医院的北京市心肺血管研究所拥有本研究所需的一切仪器设备等实验条件。（5）本研究符合现有的一切政策和法律法规。七、研究进度与考核指标时间（年、月）研究内容考核指标2012.1—2012.62012.1-2013.62013.7-2013.122014.1-2014.12准备阶段。实施阶段。资料分析阶段。整理数据按照实验设计去购买实验所需要的实验材料和试剂。完成实验材料的准备，标本的收集及实验条件的建立。按照实验设计中的步骤完成实验，认真做好实验记录。补充完善全部实验数据，对实验结果进行详细的统计学分析。撰写研究论文 八、研究预期产出（1）检测到磁微粒正常原胚组织、胚癌基因组织中的表达情况。（2）探讨上述指标在胚癌基因发生、发展中的作用。（3）发表SCI收录论文1篇、核心期刊论文1-2篇。（4）在国内外各级癌控中心的会议上进行大会发言及学术交流。（5）培养硕士研究生2名。九、研究中的伦理问题及对策本研究严格遵循医学研究中的伦理原则：尊重、知情同意、安全、防止商品化等。保护患者隐私，尊重患者参与和退出研究的自由，无任何伦理问题。十、经费预算科目申请经费备注（计算依据和说明）1.科研业务费6.0万元(1)临床观察/测试/分析费3.0万元病理标本的收集和保存(2)会议/差旅费1.0万元国外、内会议和差旅费(3)出版/文献/信息传播费1.7万元资料费、文献检索、论文发表费(4)资料印刷费0.3万元CRF表制作、知情同意书等2.实验材料费11.5万元(1)材料/试剂/药品购置费4万元购置细胞培养材料、抗体、酶类、试剂盒PBS等(2)其它7.5万元材料：0.5万元各项辅助检查费7万元3.仪器设备费0(1)购置（5万元以下设备）0(2)租赁04.合作、外协费3.0万元病理科、统计学处理 5.培训费（进修、学习）2.0万元国内外进修培训6.人员费3.0万元(1)项目组成员工资性费用（低于总经费的10%）2.5万元研究生工资费用(2)专家咨询、论证费0.5万元专家费用1,000/每人次（共5人）7.管理费1.5万元医院科研处管理费用合计27万元十一、学术委员会意见主任（签字）：年月日十二、伦理委员会意见（涉及伦理问题须单位伦理委员会讨论并出据意见）主任（签字）：年月日十五、单位意见主管院长（签字）：单位（公章）：年月日十三、申报方承诺申请者承诺：我保证申请书内容的真实性。如果获得基金资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。 签字：项目组主要参与者承诺：我保证有关申报内容的真实性。如果获得基金资助，我将严格遵守基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，加强合作，信息资源共享，认真开展工作，及时向项目负责人报送有关材料。若个人信息失实、执行项目中违反规定，本人将承担相关责任。姓名工作单位名称项目分工签字首都医科大学基础医学院标本的采集和保存首都医科大学基础医学院分子和蛋白表达的检测申报单位及合作单位承诺：已按填报说明对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对研究计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守基金委员会有关规定，督促项目负责人和项目组主要参与者以及本单位项目管理部门按照基金委员会的规定及时报送有关材料。依托单位公章合作单位公章日期：日期：