食品微生物检测讲稿

一、空气中微生物的检测一、实验目的1了解空气中微生物的分布状况，学习空气采样方法2掌握空气中微生物的检测方法二、实验原理空气是人类赖以生存的必须环境，也是微生物借以扩散的媒介。空气中存在着细菌、真菌、病毒、放线菌等多种微生物粒子，这些微生物粒子是空气污染物的重要组成部分。空气微生物主要来自于地面及实施、人和动物的蹑手呼吸道、皮肤和毛发等，它附着在空气气溶胶细小颗粒物表面，可较长时间停留在空气中。某些微生物还可以随着空气中细小颗粒穿过人体肺癌存留在肺的深处，给身体健康带来严重危害，也可以随着空气中细小颗粒物被输送到较远地区，给人体带来许多传染性的疾病和上呼吸道疾病。因此，空气微生物含量多少可以反映所在区域的空气质量，是空气环境污染的一个重要参数评价空气的清洁程度，需要测定空气中的微生物数量和空气污染微生物。测定的细菌指标有细菌总数和绿色链球菌，在必要时则测病原微生物。空气并非微生物的繁殖场所，空气中缺乏水分和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用。微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空气中，形成“气溶胶”，借风力传播。空气中的微生物中，真菌的孢子数量最多，细菌较少。而且藻类、酵母菌、病毒都会存在于空气中。目前，还无统一的关于空气的卫生学指标，一般以室内1m3空气中细菌总数为50-1,000个以上作为空气污染的指标。病原菌在空气中一般很易死亡，但结核菌、白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓灰质炎病毒等，也可以在空气中存活一段时间。尘埃多的地方，如畜舍、公共场所、医院、城市街道的空气中，微生物数量较多。高山、海洋、森林、积雪的山脉和高纬度地带的空气中，微生物较少。在本次实验中测量空气中微生物含量，主要是利用空气的自然沉降法，也有其它方法，如撞击法，过滤法等。三、实验器材电炉，培养基，培养箱，无菌台，灭菌器，牛肉膏蛋白胨培养基。 四、实验步骤1配制固体牛肉膏蛋白胨培养基1000毫升，用三角烧瓶分装，每组学生包扎13个培养皿，一起灭菌备用。2灭菌完成，在无菌台中制作平板，注意不要污染。3空气采样，在实验室的四角及中央采取五个点，每个点做两个平行，一个对照，十一个培养皿，将制备好的平板放在选取的一个点，距离地面一米左右，揭开皿盖，在空气中暴露若干时间进行采样。4采样好的培养皿置入37度培养箱中培养24h，观察并记录5计算结果：根据前苏联微生物学家估算的公式:100/A*5/T*1000/10*N=50000N/AT，其中N表示培养后菌落数，A表示平皿的表面积，T是表示培养皿在空气中的暴露时间。此公式是根据100cm2的表面积在空气中暴露5min的菌落数相当于10L空气中的菌落数来估算的，并不能代表真实空气的数量，应该比实际菌落数小。空气卫生状况标准：场所畜舍宿舍城市街道市区公园海洋上空北纬80º微生物(1~2)´1062×1045×1032001~20清洁程度细菌总数最清洁的空气（有空调）1~2清洁空气<30普通空气31~125临界环境125~150轻度污染<300严重污染>301五、实验报告1描述培养物的形态特征2计算空气中微生物含量，确定空气的卫生状况。 二、酱油中菌落总数的测定酱油俗称豉油，主要由大豆、淀粉、小麦、食盐经过制油、发酵等程序酿制而成的。酱油的成分比较复杂，除食盐的成分外，还有多种氨基酸、糖类、有机酸、色素及香料等成分。以咸味为主，亦有鲜味、香味等。它能增加和改善菜肴的口味，还能增添或改变菜肴的色泽。我国人民在数千年前就已经掌握酿制工艺了。酱油一般有老抽和生抽两种：生抽较咸，用于提鲜；老抽较淡，用于提色。老抽是加入了焦糖色、颜色很深，呈棕褐色有光泽的，焦糖是一种在食品中应用范围十分广泛的天然着色剂、是食品添加剂中的重要一员。酱油用的原料是植物性蛋白质和淀粉质。植物性蛋白质遍取自大豆榨油后的豆饼，或溶剂浸出油脂后的豆粕，也有以花生饼、蚕豆代用，传统生产中以大豆为主；淀粉质原料普遍采用小麦及麸皮，也有以碎米和玉米代用，传统生产中以面粉为主。原料经蒸熟冷却，接入纯粹培养的米曲霉菌种制成酱曲（曲是多种微生物的复合，是酿酒酿酱的原动力。要酿制它们就必须要制曲，制曲实际上是扩大培养微生物的过程。一般先用谷物为原料来富集微生物制成曲、再用曲促使更多的谷物经糖化、发酵酿成酒酱，曲的好坏直接影响着酒酱的质量和产量。因而要出好酒酱必须用好曲。），米曲霉菌半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。  酱曲移入发酵池，加盐水发酵，待酱醅成熟后，以浸出法提取酱油。制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生长发育，并大量产生和积蓄所需要的酶，如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。在发酵过程中味的形成是利用这些酶的作用。如蛋白酶及肽酶将蛋白质水解为氨基酸，产生鲜味；谷氨酰胺酶把谷物中无味的谷氨酰胺变成具有鲜味的谷氨酸；淀粉酶将淀粉水解成糖，产生甜味；果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶等能将细胞壁完全破裂，使蛋白酶和淀粉酶水解等更彻底。同时，在制曲及发酵过程中，从空气中落入的酵母和细菌也进行繁殖并分泌多种酶见，发酵是曲霉菌、酵母菌和细菌等多种微生物联合作用的结果。也可添加纯粹培养的乳酸菌和酵母菌。由乳酸菌产生适量乳酸，由酵母菌发酵生产乙醇，以及由原料成分、曲霉的代谢产物等所生产的醇、酸、醛、酯、酚、缩醛和呋喃酮等多种成分，虽多属微量，但却能构成酱油复杂的香气。此外，由原料蛋白质中的酪氨酸经氧化生成黑色素及淀粉经曲 霉淀粉酶水解为葡萄糖与氨基酸反应生成类黑素，使酱油产生鲜艳有光泽的红褐色。发酵期间的一系列极其复杂的生物化学变化所产生的鲜味、甜味、酸味、酒香、酯香与盐水的咸味相混和，最后形成色香味和风味独特的酱油。临床中经常有人询问，皮肤受伤后吃酱油会不会让伤口变黑，留下疤痕？其实，这种担心完全没必要。皮肤是否会留下疤痕，主要取决于损伤的深浅度、细菌感染程度、个体差异等因素。酱油的主要成分是谷氨酸，与组织修复没有直接关系。其中的色素是食用色素，摄入体内后也不会被输送到皮肤。因此，受伤或做过整容手术的人，不必忌食酱油。此外酱油也可分为佐餐和烹调酱油，烹调酱油一般不能生吃。_小精灵儿童网一、实验目的1、学习并掌握食品中菌落总数测定方法和原理2、了解菌落总数测定在卫生学评价中的意义二、实验原理细菌数量的表示方法由于所采用的计数方法不同而有两种：菌落总数和细菌总数。菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中形成的细菌菌落总数。以CFU/g(mL)表示。一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、pH、是否需要氧气等。菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。细菌总数：指一定数量或面积的食品样品，经过适当处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1g或1mL样品中的细菌总数来表示。样品经过处理，在一定条件下培养后（如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得的结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。三实验器材电炉，培养基，培养箱，无菌台四实验步骤1 样品处理：用点燃的酒精棉球烧灼瓶口灭菌，用石碳酸纱布盖好，再用灭菌开瓶器启开后进行检验。2 检样稀释及培养：以无菌操作，吸取酱油样品1mL，加入装有9 mL灭菌蒸馏水的灭菌玻璃瓶内经充分振摇做成1:10的均匀稀释液。稀释液主要是灭菌生理盐水，或磷酸盐缓冲液（或0.1%蛋白胨水）后者对食品已受损的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。3用lmL灭菌吸管吸取1:10稀释液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。4另取lmL灭菌吸管，按5.2.2操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支lmL灭菌吸管。5根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2一3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lmL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。6稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基(可放置于46±1℃水浴保温)注入平皿约l5mL，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有lmL稀释液的灭菌平皿内作空白对照。7待琼脂凝固后，翻转平板，置36士l℃温箱内培养48士2h。观察记录数据。五实验报告1将实验测出的样品数据以表格的方式报告并给予最终菌落数。2对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。（三）计数和报告　　1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。　　2．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。　　3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。 　　4．若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。　　5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。　　6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。　　7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。8．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm）报告。的含菌数。例次稀释液及菌落数两稀释液之比菌落总数n/或n/mL报告方式n/g或n/mL10-110-210-31136516420—1640016000或1.6*10422760295461.63775038000或3.8*10432890271602.22710027000或2.7*1044多不可计4650513—513000510000或5.1*105527115—270270或2.7*1026000—<1*10<10 7多不可计30512—3050031000或3.1*104酱油卫生标准细菌菌落总数：小于等于30000CFU/ML大肠菌群小于等于30MPN/100ML肠道致病菌：不得检出。生活饮用水菌落总数小于等于100CFU/ML桶装饮用水小于等于20大肠菌群小于等于3酱油卫生标准【GB2717—1996】1996-11-27发布1997-05-01实施 中华人民共和国卫生部发布前　　言   在对GB2717—81《酱油卫生标准》进行修订时，保留了GB2717—81中实践证明适合我国情况而又不妨碍国际通用的内容，并将酱油卫生要求分为两类，即烹调酱油和餐桌酱油，各类内容较原标准稍有变动。　　本标准于1981年首次发布，1996年11月进行第一次修订。　　本标准从实施之日起，同时代替GB2717—81。　　本标准由中华人民共和国卫生部提出。　　本标准主要起草单位：北京市食品卫生监督检验所、国内贸易部北京食品酿造研究所。　　本标准主要起草人：丁秀英、胡克强、钟冠山、朱荭、白晓光。　　本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。　　1　范围　　本标准规定了酱油的定义、卫生要求、检验方法、检验规则、包装标识、储存和运输。　　本标准适用于酱油。　　2　引用标准　　下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。　　GB2760—86食品添加剂使用卫生标准　　GB4789.1—94食品微生物学检验　总则　　GB4789.22—94食品卫生微生物学检验　调味品检验　　GB/T5009.1—1996 食品卫生检验方法　理化部分　总则　　GB/T5009.39—1996酱油卫生标准的分析方法　　GB7718—94食品标签通用标准　　3　定义　　本标准采用下列定义。　　3.1　酱油　　以粮食和其副产品为原料，经过酿造工艺制成的具有特殊色、香、味的产品。　　3.2　烹调酱油　　不直接食用的，适用于烹调加工的酱油。　　3.3　餐桌酱油　　既可直接食用，又可用于烹调加工的酱油。　　4　卫生要求　　4.1　具有正常酿造酱油的色泽、气味和滋味，无不良气味，不得有酸、苦、涩等异味和霉味，不混浊，无沉淀，无异物，无霉花浮膜。　　4.2　理化指标　　理化指标应符合表1的规定。　　4.3　微生物指标　　微生物指标应符合表2的规定。　　表1项 目指 标氨基酸态氮，%                           ≥0.4总酸（以乳酸计，适用于烹调酱油），g/100ml≤2.5砷（以As计），mg/kg                    ≤0.5铅（以Pb计），mg/kg                    ≤1黄曲霉毒素B1ug/kg                      ≤5食品添加剂                                 按GB2760规定   表2项 目指 标菌落总数（适用于餐桌酱油），个/ml        ≤30000大肠菌群，MPN/100ml                     ≤30致病菌(系指肠道致病菌)                     不得检出   5　检验方法　　5.1　感官指标　　按本标准4.1规定执行。　　5.2　理化指标　　按GB/T5009.39规定执行。　　5.3　微生物指标　　按GB 4789.22规定执行。　　6　检验规则　　6.1　采样方法　　6.1.1　理化指标检验采样依据GB/T5009.1规定。　　6.1.2　微生物指标检验采样依据GB4789.1规定。　　6.2　产品的判定　　产品应符合本标准中的各项指标，其中有一项不符合时即为不合格产品。　　6.3　产品的复检　　各项指标复检时均应加倍采样。　　6.4　如对产品的卫生质量发生异议，由省市食品卫生监督部门复检，并以其检验结果为准。　　7　包装标识、储存、运输　　7.1　包装标识　　按GB7718的规定执行，同时在产品的包装标识上必须醒目标出“用于佐餐凉拌”或“用于烹调炒菜”，散装产品亦应在大包装上标明上述内容。　　7.2　储存、运输　　产品应储存在阴凉干燥的成品库内，严禁与不洁或有毒有害物品混储。运输应防止日晒雨淋，严禁与不洁或有毒有害物品混装。三、乳酸菌饮料中霉菌测定一、实验目的掌握食品中霉菌的检验方法二、实验原理乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖 的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。以乳酸菌、双歧杆菌等为代表，对人体健康有害的叫有害菌，以大肠杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌等为代表。益生菌是一个庞大的菌群，有害菌也是一个不小的菌群，当益生菌占优势时（占总数的80%以上），人体则保持健康状态，否则处于亚健康或非健康状态。乳酸菌能促进动物生长，调节胃畅道正常菌群、维持微生态平衡，从向改善胃肠道功能；提高食物消化率和生物效价；降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长：提高机体免疫力等。乳酸菌饮料即以鲜乳或乳制品为原料经乳酸菌类培养发酵制得得乳液中加入水、糖液等调制而成得制品。成品中蛋白质含量不低于7g/l的称为乳酸菌饮料。乳酸菌饮料分两种类型：活性的乳酸菌饮料和非活性乳酸菌饮料。一种是具有活性的乳酸菌饮料，简称活性乳，就是在乳酸菌饮料中含有活的乳酸菌。按要求，每毫升活性乳中活乳酸菌的数量不应少于100万个。当人们饮用了这种饮料后，乳酸菌便沿着消化道到大肠，由于它具有活性，乳酸菌在人体的大肠内迅速繁殖，同时产酸，从而有效抑制腐败菌和致病菌的繁殖和成活，而乳酸菌则对人体无害。这种饮料要求在2~10℃下贮存和销售，密封包装的活性乳保质期为15天。另一种是非活性乳酸菌饮料，也就是通常所说的乳酸菌饮料，一般不具有活性，其中的乳酸菌在生产过程中的加热无菌处理阶段时已被杀灭。这种饮料可在常温下贮存和销售，也就不存在活性乳酸菌的功效。酸奶是鲜牛奶经灭菌消毒后加入酸（如柠檬酸或乳酸）调制而成的，或经乳酸杆菌发酵制成的乳制品。牛奶经酸化后，不仅原先牛奶中的营养成分没有被破坏，而且由于牛奶中的酪蛋白凝块更小，更有利吸收。乳酸菌饮料，虽然也在其成分中标明含有乳酸菌、牛奶等，但实际上其中只含有少量的牛奶，其中蛋白质、脂肪、铁及维生素的含量均远低于牛奶。因此从营养价值上看，乳酸菌饮料远不如酸奶，绝对不能用乳酸菌饮料代替牛奶。霉菌广泛分布于自然界并可作为食品正常菌相的一部分，长期以来人们利用某些霉菌加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美；但在某些情况下也可造成食品的腐败变质，以土壤或空气为媒介,而污染至食品原料。由于霉菌能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病菌的生长，有些霉菌能够合成有毒代谢产物。因此霉菌也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌计数来制定食品被污染的程度。食品中霉菌主要包括：1、曲霉  曲霉在自然界中分布广泛,它该霉在原料贮藏期间几乎不会死亡。因其对干燥抗性强 ,故常在一些干燥食品中被分离出来,而糖类和壳类处理工厂,也常被此类霉菌污染。曲霉会产生黄曲毒素,为天然致癌物质中致癌性最强的霉菌毒素。2、青霉  与曲霉一样在自然界中广泛分布,而且具同样的生态,但曲霉生长于中温至高温,而青霉以中温性为主,青霉也是以土壤和空气为媒介,而污染至食品原料中,是干燥性壳物产品处理工厂的主要霉菌。其有害性是造成食品腐败和产生霉菌毒素以及诱发过敏。3、枝孢霉  主要分布于空气中,与过敏有很深的关系。在工厂湿度高的环境、通风不良的环境与气温差异显著的地方(如湿的地板和天花板),常有此霉菌存在,该菌于52℃加热10min即可死亡。4、交链孢霉  属中温性和好湿性霉菌。其有害性是造成腐朽、腐败和过敏。在高湿度的工厂环境(如鱼肉、水产加工与肉食加工环境)的天花板、墙与地板、配水管的黑色霉菌,几乎为该菌或枝孢霉。5、廉孢霉  廉孢霉是生长迅速的好湿性、中温性霉菌。在自然环境中,如土壤、河川、湖泊与植物中常可分离出该菌。在湿度高的工厂环境中也常存在该菌,其可产生霉菌毒素。三、实验器材培养箱，培养皿(10个)，试管，乳酸菌饮料，三角瓶，无菌涂棒，接种环，记号笔，酒精灯，试管架，灭菌器，马丁氏培养基。马丁氏培养基配方：KH2PO41g，MgSO4·7H2O0．5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15－20g，用蒸馏水定容至1000ml，此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3．3ml如是1/3000（孟加拉红０．１克，加蒸馏水至300毫升即得1/3000浓度）孟加拉红水溶液，则需要加入100ml溶液，配方根据实际需要重新计算。由于链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基溶化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液，在100ml培养基中加1%链霉素液0．3ml，使每毫升培养基中含链霉素30μg。四、实验步骤1样品处理：吸取1ml饮料注入含有9mL无菌水的试管中,另换一支1mL无菌吸管反复吹吸, 此液为1:100稀释液，同样制作1：1000的稀释液。2培养：吸取三个稀释度的稀释液1ml注入无菌平皿，每个稀释度做两个平行，用无菌水作空白对照。将已冷却至适合温度的培养基倒入稀释液培养皿，混合均匀置入25度培养箱，恒温培养5D，观察并记录。3菌落计数：肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌。以菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）表示。选取菌落数在10CFU～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。4结果报告：计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。若有两个稀释度的平均菌落数均在10～150之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有平板上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。报告菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。五、项目指标1感官：色泽：呈均匀一致的乳白色，稍带微黄色或相应的果类色泽。  滋味和气味：口感细腻、甜度适中、酸而不涩，具有该乳酸菌饮料应有的滋味和气味，无异味。 组织状态：呈乳浊状，均匀一致不分层，允许有少量沉淀，无气泡、无异物。  2微生物指标  活性乳酸菌饮料  乳酸菌（个/mL）出厂 ≥  1×1000000  ，非活性乳酸菌饮料  有活菌检出  ，菌落总数（个/mL） ≤ 100  ，大肠菌群（个/100mL） ≤  3  ，霉菌总数（个/mL） ≤ 30，  酵母数（个/mL） ≤ 50 ， 致病菌  得检出  。六、实验报告：1计算每毫升样品霉菌菌落数。2根据实验结果描述菌落特征判断该样品是否符合霉菌菌落数卫生标准。 四、金黄色葡萄球菌的检验金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，可引起多种严重感染，有“嗜肉菌”的别称。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。2011年10月，北京市工商局查出思念牌的三鲜水饺含有金黄色葡萄球菌。11月，广州市工商局宣布“三全”以及“海霸王”的三款速冻食品也被验出含有金黄色葡萄球菌。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。有金黄色葡萄球菌感染者，可选用：红霉素、新型青霉素、庆大霉素、万古霉素或先锋霉素Ⅵ治疗。 金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆 中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F五种血清型。肠毒素可耐受100°C煮沸30分钟而不被破坏。它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。一 实验目的1了解金黄色葡萄球菌检验原理2掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法二实验原理根据本菌特有的形态及培养物质性，应用BairdParker平板进行分离，该平板中的氯化锂可以抑制绝大部分细菌生长，特别革兰氏阴性细菌生长；亚碲酸钾抑制除金黄色葡萄球菌外的革兰氏阳性菌生长，并可与蛋白胨中含硫氨基酸结合，形成的亚碲酸与硫的复合物，有抗细菌硫源代谢作用，因而可抑制其他细菌生长繁殖，此外金葡能还原碲，使菌落呈灰黑色；卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环，大部分金葡能产生卵磷脂酶，卵黄乳液使其菌落周围形成白色或者透明沉淀环。卵黄亚碲酸钾增菌剂的作用是：由于有蛋黄，所以平板不透明，典型菌落由于将亚碲酸盐还原成金属碲而中心成黑色，周围有一浑浊带，其外又由于分解卵磷脂和脂肪而形成一透明环。丙酮酸钠和甘氨酸可以修复受损细胞，可刺激金黄色葡萄球菌生长，以提高检出率，并利用分解甘露醇和血浆凝固酶等特征，以兹鉴别。三实验器材1 样品：奶、肉、蛋、鱼制品和饮料等。2 菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）3 培养基与试剂：7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-parker氏培养基、无菌盐水、兔血浆、革兰氏染色液。4 其它：显微镜、温箱、离心机、无菌吸管、无菌试管、 无菌平皿、均质器、 载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环等。四实验步骤：①金黄色葡萄球菌的检验　　样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。 　　增菌培养：将5ml10-1稀释液接入50ml7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24小时。　　分离培养：将上述稀释液或培养液分别划线10%血平板和Baird-Parker平板，置37°C培养24～48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2～3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0.5～1μm。甘露醇发酵试验：取述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，置37℃培养24h，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。血浆凝固酶试验玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴灭菌生理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取待检菌落，分别在生理盐水及血浆中充分研磨混合。血浆与菌苔混悬液在5min内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固现象者为阳性，如两者均无凝固现象则为阴性。凡玻片试验呈阴性反应或盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验。试管法：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。抗凝原理：3%柠檬酸根离子可与血中的Ca2+相结合，形成不易离解的可溶性络合物，使血液中Ca2+浓度降低，而产生抗凝作用。），仅作体外抗凝剂，主要用于血液保存。柠檬酸是三元酸，其中两个羧基可与Ca2+结合形成一个五元环。Ca2+可以与活化的凝血因子Ⅷ结合形成复合物，后者可激活凝血因子Ⅹ。活化后的凝血因子Ⅹ可以与Ca2+、磷脂已经凝血因子Ⅴ形成一个复合物，这个复合物可以将凝血酶原激活，使之转化为凝血酶。凝血酶则可以将血液中可溶性的纤维蛋白原转化为不溶性的网状的纤维蛋白，从而网罗住血液中的红细胞、白细胞等，达到止血效果。检验结果报告凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸。血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。增菌剂的配制：30％卵黄盐水50ml与除菌过滤的1％亚碲酸钾溶液10ml&127;混合，保存于冰箱内。 制法：将各成分到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25℃校正pH。分装每瓶95ml，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，每95ml加入预热到50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5ml，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。注解:（1）增菌培养本标准方法用SCDLP增菌液增菌，其成分中含有中和剂，抑菌效果较差，杂菌生长较多。在增菌培养基中加适量的亚碲酸钾（钠），当金黄色葡萄球菌生长时可将其还原，变为黑色，使培养液增加碱性；亚碲酸钾（钠）并可与蛋白胨中含硫氨基酸结合，形成的亚碲酸与硫的复合物，有抗细菌硫源代谢作用，因而可抑制其他细菌生长繁殖。（2）分离培养分离金黄色葡萄球菌的培养基有（Vogel-Johnson琼脂、BairdParker琼脂、血琼脂、卵黄高盐琼脂、TMP琼脂等、CTFA、FDA和日本的方法均用Vogel-Johson琼脂培养基。我国食品微生物标准检验方法规定BairdParker琼脂和血琼脂培养基。Vogel-Johnson琼脂和Baird-Parker琼脂的基本成分类似。为尊重传统习惯用法，在化妆品标准检验方法中只选用Baird-Parker和血琼脂二种培养基。现将各分离鉴别培养基的主要成分，作用机制和注意事项介绍如下：1）Baird-Parker和Vogel-Johnson琼脂培养基中的氯化钾可抑制革兰氏阴性菌生长，丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长，以提高检出率。2）血琼脂不仅适应金黄色葡萄球菌的生长，菌落较大，颜色鲜明，而且有鉴别溶血反应的作用，可作为血凝固酶试验的补充，增加致病菌株的检出机会。3）卵黄高盐琼脂、氯化钠用量较大，渗透压高，有抑制某些细菌的生长作用。卵黄中的卵磷脂，有促进金黄色葡萄球菌的生长发育和鉴别的作用。该菌的卵磷脂酶可分解卵磷脂，因而生长的典型菌落，表面周围有月晕状油膜，底部有乳浊圈，易于鉴别，本培养基抑菌作用较小，杂菌生长较多。表4金葡萄球菌的菌落特征Baird-Parker琼脂：圆形隆起，光滑，直径为2～3mm，呈灰色到黑色，边缘色淡，周围为一混浊带，外层有一透明带。血琼脂：金黄色，圆形隆起，边缘整齐，外周有透明的深血环，直径为1～2mm。卵黄高盐：金黄色，圆形隆起，边缘整齐，直径为1～2mm，外周有卵磷脂被分解的乳浊圈。TMP琼脂： 金黄色，圆形隆起，边缘整齐，直径0.7～1mm,周围有黄色环。4）TMP琼脂：加有适量亚碲酸钾，多量氯化钠以及甘露醇和酚红指示剂，抑制杂菌的作用较强，应适当加大接种量，取3～5环增菌液划线。金黄色葡萄球菌可还原亚碲酸钾使之变黑，并可发酵甘露醇产酸，使指示剂变黄，以致菌落呈墨黑色，周围有黄色环，容易鉴别。亚碲酸钾的用量应注意准确，因其抑菌力较强，对金黄色葡萄球菌的生长也有一定影响，因而菌落较小。（3）糖发酵试验：多数葡萄球菌菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、产酸不产气，致病性葡萄球菌在厌氧条件下分解甘露醇、产酸，非致病性葡萄球菌无此作用。（4）血浆凝固酶试验试管法是检测葡萄球菌的胞外游离血浆凝固酶（作用于凝固酶原）。玻片法是检测结合血浆凝固酶（作用于纤维蛋白原）。此法快速、简便，大多数中间型葡萄球菌和猪葡萄球菌呈阴性反应。金黄色葡萄球菌中有10～15％可呈阴性反应。有学者推荐乳胶凝集试验作为快速及常规检验方法。将1:8稀释的乳胶、悬液与等量人血浆（用EDTA处理后，经甘氨酸。盐酸缓冲液作1:1000稀释）混合制成乳胶制剂。试验时将待检菌置于加盐水的玻片上，再加一滴乳胶试剂，混匀观察结果，凝集则为血浆凝固酶阳性。本法的准确如同试管法。（5）检验报告1）按常规程序检验，凡分离出革兰氏阳性葡萄球菌的疑似菌落，经证实可发酵甘露醇、血浆凝固酶阳性的菌株，可报告检出金黄色葡萄球菌。2）如果分离的疑似菌落不发酵甘露醇，但血浆凝固酶阳性也可断定为检出金黄色萄葡球菌。3）分离出的葡萄球菌疑似菌落，不发酵甘露醇、血浆凝固醇阴性，判断未检出金黄色葡萄球菌。亚碲酸钾抑制除金黄色葡萄球菌外的革兰氏阳性菌生长;卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环;卵磷脂酶阳性的金黄色葡萄球菌分解亚碲酸钾形成黑色菌落,并分解卵磷脂形成一个透明环. 五、水中大肠菌群的检测大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌，它主要包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌、枸椽酸杆菌、克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。MPN为最大可能数(MostProbableNumber)。大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，1976年中国颁布的生活饮用水水质标准规定，每升水中大肠菌群不超过3个。它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其中大肠埃希氏菌属占绝大多数，而大肠杆菌大肠埃希氏菌典型的一种，大肠杆菌只是一种菌类，而大肠菌群是一类细菌。大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。它侵入人体一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。　　大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。大肠菌群的检验方法有两种：①发酵法。以不同量水样接种于规定数目的含有不同量标准培养基的发酵管中，在37°C经24小时培养后，如发酵管产酸产气、显微镜检验又为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则为阳性反应。根据培养和阳性的发酵管数目，按统计学原理即可得出大肠菌群数(每升或每100毫升中的个数)。因为数目是按统计学原理算出的,故称最可能数(MPN)。②滤膜法。水样通过滤膜过滤，因膜的孔径很小，大肠菌群截留在膜上。将滤膜移到远藤氏培养基上，在37°C经24小时培养后直接数典型菌落数，即得结果。由于滤膜要具有标准的孔径，以及操作上所需的技术要求较难掌握，滤膜法的使用还不普遍。两种方法所得结果不可比较。乳糖蛋白胨培养基中溴甲酚紫的作用：作为指示剂，细菌如产酸后，培养基颜色由原来的紫色变为黄色，溴甲酚紫的变色范围为5.2—6.8，颜色从黄—紫—紫红。 伊红美蓝培养基的作用：伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色，伊红和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。金葡菌在此培养基上不生长。常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H+，故菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽。一实验目的学习大肠菌群数的检测原理和方法。二实验原理水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便。由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接测它们的存在是非常困难的专业化工作。由于大肠菌群在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，因此一般采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。如果水中大肠菌群的菌数超过一定的数量，则说明此水已被粪便污染，并有可能含有病原菌。大肠菌群的定义是指一群好氧和兼性厌氧、革染氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并能在乳糖培养基中，经37℃24~48h培养能产酸产气。我国规定每升自来水中大肠菌群不得超过3个。检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析法，为我国大多数卫生单位和水厂所使用。它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。三实验材料1.样品：水样2.培养基：乳糖蛋白胨(单料及双料)，伊红美兰琼脂(EMB)平板，乳糖发酵管。3.其他：显微镜，酒精灯，无菌吸管(10m1、1m1)，接种环，载玻片等四实验步骤1培养基配制：乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。1.生活饮用水（1）初发酵试验：在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL。在10支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL，混匀后置于37℃恒温箱内培养24h。 （2）平板分离：上述各发酵管经培养24h后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落。①伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。②品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。（3）取有上述特征的群落进行革兰氏染色①用已培养18—24h的培养物涂片，涂层要薄。②将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后用水洗去。③滴加助染剂，1min后用水洗去。④滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约20—30s），用水洗去。⑤滴加复染剂，1min后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。4.复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1—3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查后附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。2.水源水（1）于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入10mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL1： 10稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。 （2）平板分离和复发酵试验的检验步骤同“生活饮用水检验方法”。（3）根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查后附表2“最可能数（MPN）表”，即求得每100mL水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L为报告单位，故MPN值再乘以10，即为1L水样中的总大肠菌群数。例如，某水样接种10mL的5管均为阳性；接种1mL的5管中有2管为阳性；接种1：10的水样1mL的5管均为阴性。从最可能数（MPN）表中查检验结果5-2-0，得知100mL水样中的总大肠菌群数为49个，故1L水样中的总大肠菌群数为49×10=490个。对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作1：10、1：100、1：1000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。如果接种的水样量不是10mL、1mL和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100mL的MPN值。 表1大肠菌群检数表接种水样总量300mL(100mL2份，10mL10份)  表2最可能数(MPN)表（接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，不同阳性及阴性情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）　　乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。　　分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。　　证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。　　报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。　　具体操作参见GB4789.3-94《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》　　现行有效新国标： 　　（二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：　　推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。　　证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。　　具体操作参见SN0169-92《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》[1]MPN检索表　　MPN为最大可能数(MostProbableNumber)的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。　　MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不相同。初发酵和证实试验　　无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。　　初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。产气量与倒管　　在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。挑选菌落 　　国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。　　另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。