分子生物学技术应用于人体肠道微生物多样性探究

分子生物学技术应用于人体肠道微生物多样性探究（解放军九四医院检验科,江西，南昌,330000）【摘要】随着分子生物学、基因组学和生物信息学的发展，微生物的分子水平上的研究也取得了快速发展，与其他方法相比，其灵敏度高、可重复好和可靠性好，是目前应用最广泛的方法之一。【关键词】分子生物学；技术；肠道微生物【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】1005-1074(2009)04-0032-016 人体肠道中寄生着种类繁多和数量巨大的微生物，构成了肠道微生态体系。这正常情况下，这些微生物对机体无害，或有利于机体的健康，为正常菌群。正常菌群参与宿主对营养素的消化、吸收与合成；刺激其免疫机制。这种与宿主的肠道相互依存又相互影响的关系形成了动态的微生物平衡[1]。微生物学研究表明，环境条件的轻微变化，均可导致机体微生态系统的变化，造成菌群的失调，对宿主的肠道功能产生不良影响[2]。肠道微生态的破坏，还可引起内外源性感染，干扰机体营养代谢和免疫功能，甚至严重影响机体健康，导致一系列疾病的发生。随着分子生物学、基因组学和生物信息学的发展，微生物的分子水平上的研究也取得了快速发展，与其他方法相比，其灵敏度高、可重复好和可靠性好，是目前应用最广泛的方法之一。1肠道微生物总DNA的提取肠道微生物总DNA的提取是研究胃肠道微生态系统的基础，只有获得尽可能完整的DNA模板才能为后续分析提供可信性。目前获得肠道菌群总DNA的方法主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法，以及近年来一些大型公司推出的商业试剂盒。酚/氯仿抽提法间接从样品中获取基因组DNA是实验室常用提取细菌DNA的方法，金晶等[3]通过对酚/氯仿法提取肠道微生物总DNA进行优化，得到了基本完整的基因组DNA.这一经典的技术由于其操作过程不需要特殊的仪器设备，得到的DNA纯度相对较高，被广泛的应用。2肠道微生物基因片段获取Sharles等于1990年在E.Coli基因组中发现的一种基因间重复保守序列，大小约为126bp。1991年，Hulton等在Salmonellatyphimurium，Yersiniapseudo-tuberculosis，Klebsiellapneumoniae和Vibriocholerae中也发现这种高度保守的重复序列，由于该序列主要存在与肠杆菌科，故称之为肠杆菌基因间的重复共有序列（Enterobacterialrepetitive6 intergenic，ERIC）。Versalovic等认为ERIC-PCR扩增的是两个相邻的ERIC保守序列之间的区域，由于不同的细菌基因组上的ERIC重复序列的数目和分布不同，从而得到由一系列大小不同片段组成的DNA指纹图谱不同地域和不同年代的同一株菌其指纹图谱一样，不同的方法提取基因组DNA，图谱具有良好的可重复性。潘莉等[4]为了了解以粪检有无白细胞区分的两类腹泻儿童肠道菌群结构的特征及其与健康儿童的差别，应用ERIC-PCR对其肠道微生物总DNA进行扩增，结果分析发现了一段与腹泻相关的未知基因序列。在检测运动员不同训练强度下肠道菌群结果变化ERIC-PCR也能取得很好的结果[5]。3DNA遗传指纹图谱技术分析3.1变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE)是由Fisher和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其原理是利用长度相同的双链DNA片段解链温度的不同，通过梯度变性胶将DNA片段分离开来。DGGE可以用来检测除最高温度解链区域以外的所有发生单个碱基变化的DNA片段。另一个基于相似原理的技术，称为温度梯度凝胶电泳(TemperatureGradientGelElectrophoresis，TGGE)，与DGGE的不同之处在于不是变性剂呈现线性梯度，而是温度呈现线性梯度，使得不同的核酸序列停留在凝胶的不同位置从而得以分离。该技术很突出的优点：可以分离具有细微差异的基因组片段；从凝胶中切下谱带，然后测序6 分析来揭示群落成员系统发育的从属关系，检测出特异细菌种群的存在；具有同时检测多个样品，可以对不同样品进行比较。3.2限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段，于是电泳图谱呈现多态性。末端限制性片段长度多态性分析(TerminalRestrictionFragmentLengthPolymorphisn，T-RFLP)与RFLP相似，只是在PCR引物末端标记荧光，扩增的基因片段被限制性内切酶消化后，那些带有荧光标记的末端限制性片段就可在DNA测序仪上检测出来。Cecilia等[6]利用T-RFLP技术分析抗生素治疗和服用益生菌产品对人类肠道微生物区系的影响，结果表明T-RFLP技术易于监控部分优势菌群，但是利用培养技术却很实现对它们的监控。3.3分子杂交技术-荧光原位杂交荧光原位杂交(FluorescenceInSituHybridization,FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。基本原理是：如果被检测的细菌基因组DNA纤维切片上的靶6 DNA与所用的核酸探针是同源互补的，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。该法具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点。�人体肠道微生态系统的动态平衡对生理、健康有着重要作用，分子生物学技术的快速发展使研究人体肠道微生物各种群的数量、结构及动态变化更为直接和精确。当然，分子生物学技术人目前尚有一些缺陷，在与传统的培养鉴定方法方法结合使用，将能够在人体胃肠道复杂的微生物生态研究中发挥重要的作用。参考文献[1]杨汝德,李武明，许燕滨．动物和人类的肠道菌群的形成及意义[J]．微生物学杂志，1998，18（1）：52-55．[2]顾国胜，任建安，黎介寿．结肠粘膜表面保护系统与肠道菌群[J]．中国使用外科杂志，2003,23（2）:118-120．[3]金晶，彭颖，李晓波．快速提取肠道微生物基因组DNA的方法[J]．现代生物医学进展，2007，7（1）：100-103．[4]潘莉，杜惠敏，黄海冬,等．腹泻儿童肠道菌群结构特征的ERIC-PCR指纹图分析[J]．中国微生态学杂志，2003，15（13）：141-143．6 [5]乔德才，陈敬，魏桂芳，等．用DNA指纹图谱技术分析运动负荷对运动员肠道菌群区系结构的影响[J]．体育科学，2004，24（1）：73-75．[6]CeciliaJernberg,AsaSullivan,etal.Monitoringofantibiotic-inducedalterationsinthehumanintestinalmicroflaraanddetectionofprobioticstrainsbyuseofterminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism[J].ApplEnvironMicrobiol,2005,71(1):501-506.(收稿日期：2009.01.20)6