分子生物学的笔记2

DNA的复制一、DNA复制的方式及一般过程：(一)DNA的半保留复制(semiconservativereplication)Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测，DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。（二）DNA复制的一般过程：DNA双螺旋是由两条方向相反的单链组成，复制开始时，双链打开，形成一个复制叉或复制泡，两条单链分别做模板，各自合成一条新的DNA链。由于DNA一条链的走向是5′→3′方向，另一条链的走向是3′→5′方向，但生物体内DNA聚合酶只能催化DNA从5′→3′的方向合成。在以3′→5′方向的母链为模板时，复制合成出一条5′→3′方向的前导链(leadingstrand)，前导链的前进方向与复制叉打开方向是一致的，因此前导链的合成是连续进行的。而另一条母链DNA是5′→3′方向，它作为模板时，复制合成许多条5′→3′方向的短链，叫做随从链(laggingstrand)，随从链的前进方向是与复制叉的打开方向相反的。随从链只能先以片段的形式合成，这些片段就叫做岗崎片段(Okazakifragments)，原核生物岗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般10000核苷酸。最后再将多个岗崎片段连接成一条完整的链。由于前导链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制(图3-7)。二、DNA复制过程的三个阶段第一个阶段为DNA复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成。第二阶段为DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。第三阶段为DNA复制的终止阶段。（一）DNA复制的起始阶段：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(originofreplication)常用ori或o表示。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中只有一个复制起始点，即有一个复制子。在真核生物中复制是从许多起始点同时开始的，即有许多个复制子。1、DNA复制起始点的结构特性：大肠杆菌复制起始点Ori由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)。有些生物复制起始点Ori是富含A•T的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。2、DNA复制的方向性：(1)定点开始双向复制；(2)定点开始单向复制;(3)两点开始单向复制;。3、DNA复制的起始：DNA双螺旋的解旋由多种酶来完成的。DNA解链酶：能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。单链结合蛋白（SSB蛋白）：能保证解开的双链保持单链结构，但不起解链作用。RNA聚合酶：合成RNA引物，再由DNA聚合酶合成新的DNA链。 （二）DNA链的延长DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将游离的四种脱氧单核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,简写为dNTP)聚合成DNA的过程这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多种酶和蛋白质参与，现分别叙述它们在DNA复制中的作用。1、DNA聚合酶：实验证明大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNApolⅢ起作用，而DNApolⅠ和DNApolⅡ在DNA错配的校正和修复中起作用。DNA聚合酶的共同性质：①需要DNA模板；②需要RNA做为引物；③催化dNTP加到引物的3′-OH末端，因而DNA合成的方向是5′→3′；④三种DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。DNA聚合酶Ⅰ和II主要起到修复DNA和复制的准确性中发挥作用；DNA聚合酶III是DNA复制链延长反应中的主导聚合酶。真核生物DNA聚合酶：真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。复制中起主要作用的是DNApolα。DNApolβ与DNA修复有关。DNApolγ在线粒体DNA的复制中起作用。DNApolδ前导链的合成靠DNApolδ催化，并且还需要一种细胞周期调节因子（proliferatingcellnucleusantigen,PCNA)参与而随从链的合成靠DNApolα和引发酶配合作用完成。2、与超螺旋松驰有关的酶：拓扑异构酶(topoisomerase)是一类改变DNA拓扑性质的酶。在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应，而在生物体内它们可能参与了DNA的复制与转录。在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及DNA的合成。DNA拓扑异构酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它们广泛存在于原核生物及真核生物中。（三）DNA复制的终止阶段DNA合成出的前导链为一条连续的长链。随从链则是由许多相邻的片段，在连接酶的催化下，以3′、5′－磷酸二酯键相连接成为一条长链。连接反应中的能量来自ATP(或NAD＋)。真核生物DNA聚合酶主要以α、β、γ三种酶为主，α是关键酶，一般不具有外切酶活性。真核生物线性DNA末端具有端粒结构。人的端粒DNA约5-15kb。端粒的功能：保证线性DNA的完整复制；保护染色体末端不受核酸酶水解和不发生染色体的异常重组；决定细胞的寿命，体细胞端粒酶活性低。随着复制次数的增加端粒DNA逐步缩短，细胞逐渐停止分裂，而进入凋亡。1、反转录酶的催化作用：反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′OH末端上，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementaryDNA,cDNA)。它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。2、反转录酶的特点：①RNA指导的DNA聚合酶活性；以RNA为模板，RNA为引物（多为色氨酸tRNA）催化dNTP聚合。不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH（水解酶）活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以cDNA为模板以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。此外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。3、反转录酶发现的意义：反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。基因重组和基因移动：基因重组：通过各种途径，使一个基因的DNA序列来源于两个或两个以上亲本DNA的序列，称为基因重组。基因移动：基因从一处移动到另一处，称为基因移动。可移动基因一般通过转座子形式进行移动。几乎所有生物细胞中都存在可移动基因。基因重组和基因移动是生物进化的动力，具有重要的生物学意义。1、基因重组同源重组：是任何具有一段同源序列的两个基因DNA序列之间的交换。发生同源重组的条件：两个DNA分子之间存在同源序列，而且同源区序列越长，重组发生率越高，同源区序列太短，很难发生重组。位点特异性重组：与同源重组不同，它发生在位点特异的短序列区。如λ噬菌体重组特异位点和大肠杆菌重组特异位点有15bp的序列是相同的：GCTTTTTTATACTAA                2、基因移动插入序列（insertionsequence，IS）也称简单转座子，仅含有转作所需的序列和促进转座过程的蛋白（如转座酶）基因。每一种IS元件都有不同的序列，但有一些共同的特征：它们都是短序列（约1kb)，两端是短的反向重复序列转座子（Transposon,Tn）：也称复合转座子，除了含有转座所需序列和转座酶基因以外，在中心区还有其它基因，常是抗生素抗性基因。病原菌所以产生抗药性，在细菌群体中传布就是通过转座子。真核细胞转座子真核转座机制涉及一个RNA中间体，类似于逆转录病毒（RNA病毒），所以有时把它称为逆转录转座子。转座时通过RNA中间体，再通过逆转录酶合成一个RNA的DNA拷贝，再向原核一样插入靶DNA。差别主要在于真核转座通过RNA中间体。（可能是真核基因不连续性造成的）转座的遗传学效应a、转座引起插入突变，可导致基因表达失活。b、转座产生新的基因。c、转座产生的染色体畸变，引起DNA缺  失或倒位。d、转座引起的生物进化，可产生新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子。四、基因突变和基因的损伤与修复1、基因突变的分类：a、点突变：DNA分子中单个碱基的改变，一种碱基被另一种碱基取代。同类碱基之间取代，称转换；否则称颠换。b、碱基的插入突变：在DNA的某一位点插入一个或一个以上的碱基。c、碱基丢失突变：在DNA的某一位点缺失一个或一个以上的碱基。2、突变可能造成的后果： a、突变可能使生物更有利于适应环境，引起生物进化。b、导致生物体的死亡，属致死突变。c、引起结构、形态和功能的异常，产生先天性疾病。d、引起细胞的癌变，癌基因和抑癌基因的突变是许多肿瘤发生的原因。e、不发生任何变化和影响。3、  基因突变的特征：a、突变以一定的概率随机发生。b、突变有可逆性。c、突变的发生频率可被外界因素（化学、物理、生物等）所加强。d、突变是可以遗传的。4、基因的损伤:基因损伤具有比基因突变范围更广的概念，一切使DNA结构和功能发生改变的DNA变化，都可称为基因的损伤。突变也是DNA损伤的一种，除以上的突变类型外，还包括：a、碱基损伤。b、DNA链断裂，有单链断裂和双列断裂。引起基因损伤的因素：1）物理因素：a、紫外线：紫外线照射可能引起DNA连上两个相邻的胸腺嘧啶发生聚合反应，形成胸腺嘧啶二聚体，阻止DNA的复制和转录。b、电离辐射：X、α、β、γ射线引起DNA的损伤。包括DNA的主链断裂，一条或两条的断裂，碱基聚合，糖苷链的断裂等，引起大片段损伤或丢失，造成染色体畸变、基因突变、细胞死亡等。2）化学因素a、烷化剂：烷化剂可与DNA碱基（或糖基上的羟基）发生烷基化反应，生成烷基化碱基。可引起配对错误，发生突变。b、核苷酸类似物：如5-溴尿嘧啶，是胸腺嘧啶的类似物，在DNA复制时取代胸腺嘧啶进入DNA。5-溴尿嘧啶在体内，以烯醇式存在，再次复制时，与G配对，引起碱基置换突变。c、代谢产生的活性物质：有两类代谢产生的活性物质，以是从外界进入人体的化合物，本身没有活性，经体内的代谢反应后，产生具有很强反应性的代谢产物，例如苯并芘、黄曲霉毒素等。3）生物因素  DNA病毒和RNA病毒感染、质粒转移、基因重组、转座子的转位等都可能使DNA发生改变，引起基因突变。  4）自发损伤或突变生物体不接触任何致突变剂，也可能自发的发生基因突变。包括：DNA复制时的碱基错误配对；碱基的互变异构；脱氨基。5、基因修复1）直接修复：a、光修复：是一种酶促反应过程，通过光修复酶，可以修复因紫外线照射引起的嘧啶二聚体的DNA损伤。b、烷基转移修复：通过甲基转移酶，对引起甲基化的DNA损伤进行修复。2）碱基切除修复：主要修复小段DNA的损伤，是在DNA聚合酶、DNA糖苷酶、内切酶和连接酶的参与下完成的。3)核苷酸切除修复：是大段DNA损伤修复系统，由ATP依赖的切除核酸酶进行δε双切除，即在损伤部位的两侧切开磷酸二酯键，除去损伤的寡核苷酸。留下的缺口，由DNA聚合酶I或DNA聚合酶δ或ε进行修补合成，最后由DNA连接酶连接。