环境微生物实验指导书

试验一培养基的配制及灭菌【目的要求】1．了解培养基的概念、种类及用途2．了解培养基的配制原理及其常规配制程序3．学习和掌握细菌、放线菌、霉菌、酵母菌常用培养基的配制方法。【基本原理】培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。高氏一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。马丁氏培养基和豆芽汁葡萄糖培养基分别用于霉菌和酵母菌的分离培养。【材料与用品】1．材料与试剂牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、黄豆芽、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、MgSO4•7H2O、NaOH溶液（1mol/L）。【仪器与用品】天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、pH试纸、棉花、纱布、牛皮纸、线绳、报纸等。一、肉膏蛋白胨培养基的配制1．培养基成分牛肉膏0.3g蛋白陈1gNaCl0.5g琼脂1.5g水100mlpH7.2~7.42．配制方法 （1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于唐瓷缸中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述唐瓷缸中。将唐瓷缸加热，用玻璃棒搅拌，使药品全部溶化。（2）加琼脂：加入所需量的琼脂，加热融化。（3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/lNaOH溶液调pH至7.2~7.4。（5）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌20分钟。待培养基冷却至50℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。二、高氏一号培养基的配制1．培养基成分可溶性淀粉20gKNO31gNaCl0.5gK2HPO40.5gMgSO40.5gFeSO40.01g琼脂20g水1000mlpH7.2～7.42．配制方法（1）称量及溶化：量取所需水量的2/3左右加入到搪瓷缸中，加热至沸腾。称量可溶性淀粉，置于另一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，然后到如上述沸水的搪瓷缸中，继续加热，使淀粉完全融化。分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4，依次逐一加入水中溶解。（2）加琼脂：加入所需量的琼脂，加热融化。（3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/lNaOH溶液调pH至7.2~7.4。（5）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌20分钟。 待培养基冷却至50℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。三、马丁氏培养基的配制1．培养基成分葡萄糖10g蛋白胨5gK2HPO41gMgSO4•7H2O0.5g琼脂16g水1000ml链霉素溶液（10000U/ml）3.3ml（临用前加入）的2．配制方法（1）称量：称取培养基各成分的所需量。（2）溶化：在搪瓷缸中加入约2/3所需水量，然后依次逐一加入并溶化培养基各成分，再按1000ml培养基加入3.3ml的0.1％孟加拉红溶液。（3）加琼脂：加入所需量的琼脂，加热融化。（4）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（5）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌20分钟。（7）临用前，加热融化培养基，待冷却至60℃左右，按每1000ml培养基以无菌操作加入3.3ml的链霉素溶液，迅速混匀。四、豆芽汁葡萄糖培养基的配制1．培养基成分黄豆芽10g葡萄糖5g水100ml2．配制方法（1）称取新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100ml水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。（2）按100ml10％豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入2g 琼脂，继续加热溶化，补足失水。（3）分装、加塞、包扎。（4）高压蒸汽灭菌20分钟。待培养基冷却至50℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。【思考题】1．制作平板培养基的注意事项是什么？2．培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌？如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处？3．如何检查灭菌后的培养基是否无菌？4．在马丁氏培养基的配制中，链霉素为什么要临用前才加入？5．如果你需要配制一种含有某抗生素的牛肉膏蛋白胨培养基，其抗生素的终浓度(或工作浓度)为50μg/ml，你将如何操作?实验二四大类微生物的分离和培养【目的要求】1．掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离技术。2．学习从样品种分离、纯化出所需菌株。3．了解培养细菌、放线菌、酵母菌以及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。【基本原理】土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量较多。本实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌，从面曲中分离酵母菌。为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品的季节、气温条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免样品种各类微生物相互干扰。细菌或放线菌在中性或微碱性 环境较多，但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10％酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌。酵母菌和霉菌都喜欢酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH5时生长极快。而细菌生长适宜的酸碱度为pH7，所以，分离酵母菌时只要选择适宜的培养基和pH，可降低细菌增值率，霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增值率，一般培养基临用前添加灭过菌的链霉素。【材料与用品】1．菌源选定采土地点后，铲去表涂层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g，酵母菌分离采用面曲。2．培养基肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏合成一号培养基、豆芽汁葡萄糖培养基3．无菌水4．其他试剂与用品无菌培养皿、无菌移液管、玻璃涂棒、1％重铬酸钾等。【实验步骤】一、细菌分离1．制备土壤稀释液称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10min，使土壤中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10－2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10－7稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5ml无菌水试管6支，按10－3……10－7顺序编号，放置在试管架上。取移液管一支，准确吸取0.5ml10－2土壤稀释液，此为10－3稀释度的土壤稀释液，依次操作，制成10－4、10－5、10－6、10－7的土壤稀释液。2．涂布分离用无菌移液管分别吸取上述10－7、10－6、10－5、三个稀释度菌悬液0.1ml，依次加入对应编号已经准备好的平板上。右手持无菌玻璃涂棒，左手那培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒将菌也自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。每个稀释度涂两个平板。3．恒温培养将平板置于30℃恒温培养箱中培养24h后观察结果。二、放线菌分离1．制备土壤稀释液称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，并加入10滴1％重铬酸钾溶液。振荡后静置5min，即成10－2稀释度的土壤稀释液。2．涂布分离 用无菌移液管分别吸取上述10－5、10－4、10－3、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。3．培养将涂好的平板放于28℃恒温培养箱中培养5～7d后观察结果。三、霉菌的分离1．制备土壤稀释液称取土样5g，加入盛有95ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成10－2稀释度的土壤稀释液。2．涂布分离将已灭菌的培养基溶化，加入链霉素溶液，待培养基凝固后，用无菌移液管分别吸取10－4、10－3、10－2、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。3．培养将涂好的平板放于28℃恒温培养箱中培养3～5d后观察结果。四、酵母菌的分离1．制备菌悬液称取面曲1g，加入加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，用玻璃帮将面曲捣碎，振荡20min，即成10－2稀释度的面曲稀释液。2．涂布分离用无菌移液管分别吸取10－6、10－5、10－4、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。3．培养将涂好的平板放于30℃恒温培养箱中培养2～3d后观察结果。【思考题】1．稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50℃左右，才倒入装有菌液的培养皿内？2．在恒温培养箱中培养微生物时为什么培养皿需倒置？ 实验三显微镜的使用【目的要求】1．了解普通光学显微镜的构造和原理。2．正确掌握使用显微镜的方法。【基本原理】显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成（图1-1）。光学显微镜的构造(图1-1)1.物镜转换器2.接物镜3.游标卡尺4.载物台5.聚光器6.彩虹光阑7.光源8.镜座9.电源开关10.光源滑动变阻器11.粗调螺旋12.微调螺旋13.镜臂14.镜筒15.目镜16.标本移动螺旋1．机械装置镜座（base）和镜臂（arm）镜座位于显微镜底部，呈马蹄形，它支持全镜。镜臂有固定式和活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。镜筒（bodytube）是由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种，单筒又可分为直立式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜45°。双筒中的一个目镜有屈光度调节装置，以备在两眼视力不同的情况下调节使用。转换器（nosepiece）为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装3—4个物镜，可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。载物台（stage） 又称镜台，为方形或圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一个通光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器，将标本固定后，能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度，能确定标本的位置，便于找到变换的视野。调焦装置是调节物镜和标本间距离的机件，有粗动螺旋（coarseadjustment）即粗调节器和微动螺旋（fineadjustment）即细调节器，利用它们使镜筒或镜台上下移动，当物体在物镜和目镜焦点上时，则得到清晰的图像。2．光学系统物镜（objective）物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接物镜。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如：NA0．30；10×；160/0．17；16mm。其中“NA0．30”表示数值孔径（numericalaperture，简写为NA），“10×”表示放大倍数，“160/0．17”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度（mm），16mm表示焦距。目镜（ocularlens）装于镜筒上端，由两块透镜组成。镜把物镜造成的像再次放大，不增加分辨力，上面一般标有7×、10×、15×等放大倍数，可根据需要选用。一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500—700倍，最大也不能超过1000倍的选择。目镜的放大倍数过大，反而影响观察效果。聚光器（condenser）光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本，增强照明度和造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜和虹彩光圈（irisdiaphragm）组成，聚光镜由透镜组成，其数值孔径可大于1，当使用大于1的聚光镜时，需在聚光镜和载玻片之间加香柏油，否则只能达到1．0。虹彩光圈由簿金属片组成，中心形成圆孔，推动把手可随意调整透进光的强弱。调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。光源（lightsource）较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内，通过按钮开关来控制；老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜，反光镜是一个两面镜子，一面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观察时，用平面反光镜；使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。滤光片（filter）可见光是各种颜色的光组成的，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。三、油镜物镜的基本原理微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40—45×）和油镜（1．8mm，95—100×）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI（oilimmer-sion）字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000—2000多倍。从图Ⅲ-3中可看出油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度（图1-2）。 (图1-1)利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NA＝n·sinα式中NA=数值孔径；n=介质折射率；α=最大入射角的半数，即镜口角的半数。　因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，α的理论限度为90°，sin90°=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120°，其半数的正弦为sin60°=0．87，则：以空气为介质时：NA=1×0．87=0．87以水为介质时：NA=1．33×0．87=1．15以香柏油为介质时：NA=1．52×0．87=1．32显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。　　　　　　式中λ=光波波长。 我们肉眼所能感受的光波平均长度为0．55μm，假如数值孔径为0．65的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为0．42μm。而在0．42μm以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1．25的油镜时，能辨别两点之间的　　　　　　　　因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（NA=0．65），和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0．42μm。假如采用放大率为90倍的油镜（NA=1．25），和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出0．22μm间的距离。【材料与器材】显微镜、香柏油、擦镜纸、吸水纸等。细菌，酵母菌，霉菌等标本。【实验步骤】1．观察前的准备（1）1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。（2）将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。（3）调节光照:不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10×物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。2.低倍镜观察镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。3．高倍镜观察在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，慢慢下降载物台直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察,并准备用油镜观察。4．油镜观察（1）用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。（2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 （3）从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。（4）从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。5.观察完后复原下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醇擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2—3下即可，（注意向一个方向擦拭）。将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将载物台下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。【注意事项】1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。4.观察标本时，必须依次用低、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。5.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。思考题1.油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？2.使用油镜时，为什么必须用香柏油？3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？4.绘出你所观察微生物的基本形态。 实验四纯培养菌种的菌体、菌落形态观察【目的要求】1．学习并掌握观察细菌、放线菌、酵母菌以及霉菌个体形态的基本方法。2．初步了几种中细菌的个体形态以及与其相应的菌落形态特征。3．通过观察和比较分离出来的细菌以及放线菌、酵母菌及霉菌的菌落特征，掌握初步鉴别上述微生物的方法。【材料与用品】上个实验培养出来的各种细菌，酵母菌，霉菌以及放线菌。【操作步骤】一、细菌、霉菌、放线菌、酵母的培养。（略）二、菌落形态特征的观察由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特征及产生色素的能力等各不相同，因而个体及它们的群体在固体培养基上的生长状况也不一样。根据微生物的固体培养基上相成的菌落特证，可初步辨别它们的分类地位。观察时，应注意菌落的形状，大小、表面结构、边缘结构、颜色、透明度、气味、黏滞性、质地软硬情况、表面光滑与粗糙情况等。通常，细菌菌落多为光滑型、湿润、质地软，表面结构及边缘结构特征很多，具有各种颜色。但也有干燥、粗糙的菌落，甚至呈霉状但不起绒毛。酵母菌菌落呈圆形，比细菌菌落大，表面光滑，质地软，颜色多为白色或红色。放线菌的菌落硬度较大，干燥致密，且与培养基结合紧密，不易被挑取。菌落表面呈粉状或皱褶呈龟裂状，具有各种颜色，正面和背面颜色不同。霉菌菌落长成绒状或棉絮状，能扩散生长，疏松，很容易挑取。也具有各种颜色，如白色，绿色，灰色等，正面和背面不尽相同。三、细菌、放线菌、酵母菌及霉菌菌落特征的比较对分离培养出来的细菌，酵母菌，放线菌及霉菌的菌落特征仔细观察，并将上述四种微生物进行比较，做仔细记录。【实验结果】填写下表 菌落特征名称形状菌落大小（cm）表面光泽与培养基结合程度细菌放线菌霉菌酵母菌思考题1．菌落干燥与湿润的原因是什么？2．具有鞭毛、荚膜的细菌在它们形成菌落时，一般会有哪些相应的特征？ 实验五微生物细胞大小的测定　　一、目的要求1.学会测微尺的使用和计算方法。2.掌握酵母菌细胞大小测定的方法。二、基本原理　　微生物细胞大小，是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。　　镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片。一般将1mm等分为100格（或2mm等分为200格），每格长度等于0．01mm（即106μm）。是专用于校正目镜测微尺每格长度的。　　目镜测微尺是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片，其中央刻有精确的刻度，有等分50小格或100小格两种，每5小格间有一长线相隔。由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同，因此，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，在使用前必须用镜台测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值，然后才可用来测量微生物的大小。　　三、器材　酵母菌悬液，目镜测微尺，镜台测微尺，显微镜，擦镜纸，香柏油等。　　四、操作步骤　　1．目镜测微尺的标定　　(1)放置目镜测微尺取出接目镜，旋开接目镜透镜，将目镜测微尺的刻度朝下放在接目镜筒内的隔板上（图Ⅳ-4，B），然后旋上接目透镜，最后将此接目镜插入镜筒内（图Ⅳ-4，C）。　　(2)放置镜台测微尺将镜台测微尺置于显微镜的载物台上，使刻度面朝上。 　　(3)校正目镜测微尺先用低倍镜观察，对准焦距，当看清镜台测微尺后，转动接目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两对刻度线完全重合，然后计数出两对重合线之间各自所占的格数（图Ⅳ-6）。　　根据计数得到的目镜测微尺和镜台测微尺重合线之间各自所占的格数，通过如下公式换算出目镜测微尺每小格所代表的实际长度。　　目镜测微尺每小格长度（μm）=　　同法校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。　　2．菌体大小的测定　　目镜测微尺校正后，移去镜台测微尺，换上酵母玻片标本，校正焦距使菌体清晰，转动目镜测微尺（或转动染色标本），测出酵母的长和宽各占几小格，将测得的格数乘以目镜测微尺每小格所代表的长度，即可换算出此单个菌体的大小值，在同一涂片上需测定10至20个菌体，求出其平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体来进行测定。　　3．取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭后，放回盒内保存。YPD(YEPD)培养基YPD是用于酵母常规生长的复合培养基。酵母提取物    10g蛋白胨    20 g葡萄糖    20g加水至    1000 ml制备平板时，在高压灭菌前加入20 g细菌培养用琼脂(终浓度为2％)。　　五、实验报告　　1．结果　　(1)将目镜测微尺校正结果填入下表。　　 　　(2)将测量酵母大小结果填入下表。　　　　2．思考题当接目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变接物镜，目镜测微尺每格所量的镜台上物体的实际长度是否相同？为什么？实验六微生物显微计数-－血球计数板法　　一、目的要求　　1．了解血球计数板的构造和使用方法。　　2．学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。　　二、基本原理　　利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0．1mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。　　血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。 　　每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。　　在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。　　下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数　　因1ml=1cm3=1000mm3，　　　　　　　　　　　　　　　=50000A·B（个）　　同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A＇，则　　　　　　　三、器材　　酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。　　四、操作步骤　　1．稀释　　将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。　　2．镜检计数室　　在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。　　3．加样品 　　将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。　　4．显微镜计数　　静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。　　5．清洗血球计数板　　使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。　　五、实验报告　　1．结果　　将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。　　2．思考题　　根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？实验七革兰氏染色法一、目的要求1、学习并初步掌握革兰氏染色法2、了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basicdye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorisingagent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystalviolet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。三、器材1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。2、其他：革兰氏染色液，载玻片，显微镜、盖玻片、吸水纸，接种针。四、操作步骤1.涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。2.染色（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。（3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。（5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。培养基成分牛肉膏0.3g蛋白陈1gNaCl0.5g琼脂1.5g 水100mlpH7.2~7.4五、实验报告　1．结果：在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？2．思考题 (1)你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？  (2)为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?(3)如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题?如果加热温度过高、时间太长，又会怎么样呢？（4）革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？（5）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？（6）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性和革兰氏阴性菌分别是什么颜色？（7）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？