2009上微生物学实验 讲稿

实验一培养基的制作及灭菌（4学时P78~104）一、实验目的明确培养基的配制原理；掌握细菌和真菌培养基的制备方法和步骤。二、实验原理1、培养基牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。在配方中不加琼脂时称之为肉汤培养基，常用于扩大培养；加入琼脂配制的固体培养基一般用于细菌的分离培养、测数等。马铃薯蔗糖培养基是一种半合成培养基，常用于培养多种真菌，如酵母、霉菌和蕈菌（食用菌）等。2、灭菌灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称为灭菌。分干热和湿热灭菌。一般培养基使用高压蒸汽灭菌，0.1MPa，灭菌15～30min。P100～103消毒：用较温和的物理或化学方法杀死病原微生物和有害微生物等绝大多数微生物，即部分灭菌。三、主要实验器材1、药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10%NaOH溶液、10%盐酸溶液；新鲜马铃薯、蔗糖（葡萄糖）。2、器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度搪瓷杯、玻棒、pH试纸、试管、分装漏斗、棉花、棉线；天平、小刀、纱布、试管、菜板；高压蒸汽灭菌锅。四、实验掌握要点试管、三角瓶的包扎；培养基的分装；灭菌参数。15 五、实验内容与操作：（一）培养基配方1、牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂20g，水1000mL，pH7.0。2、马铃薯蔗糖培养基的配制（P214）去皮马铃薯小块200g，蔗糖（或葡萄糖）20g，琼脂20g，水1000mL，pH自然。（二）操作步骤分四组：一、二组分别做牛膏斜面和三角瓶，三、四组做马铃薯的斜面和三角瓶。1、配制牛肉膏蛋白胨培养基操作步骤（1）按配方称取药品，加入盛有500mL水的铝锅中，加热溶解药品。（2）再加入洗净的琼脂条（粉），搅拌、加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000mL。（3）用玻棒沾少许溶液，测定pH值，用NaOH或HCl调节pH至7.0。（4）用分装漏斗装入18mm×180mm试管（6～8mL）中，塞好棉塞，用报纸或牛皮纸包扎棉塞部分，直立装入试管篓中，放入高压灭菌锅内，于121℃，0.1MPa，灭菌30min。（5）灭菌后，趁热摆放斜面。冷却后，于37℃培养24h做无菌检测。2、配制马铃薯蔗糖培养基操作步骤（1）马铃薯去皮，称取200g，切成1cm小方块，置入小铝锅中，加1000mL水，置电炉上煮沸20min，用双层纱布过滤。将滤液补水至1000mL煮沸。（2）加入蔗糖、洗净的琼脂条（粉），搅拌、加热至琼脂完全熔化，再补足水量至1000mL。（3）分装、灭菌、摆放斜面，操作同上。六、作业与思考题1、培养细菌常用的培养基？什么肉汤培养基？2、培养真菌的常用培养基？15 实验二显微镜的使用及蓝细菌和酵母菌的形态观察（4学时p1～35，47，53）一、实验目的熟练掌握光学显微镜使用方法，利用水浸片法观察酵母菌、蓝细菌的形态特征。二、实验原理1、普通光学显微镜的构造、成像原理、性能及使用方法P1～92、蓝细菌P47是光能营养菌，广泛分布于自然界中，在极端环境中也能生长。部分蓝细菌还具有固定空气中氮素的能力，一些蓝细菌还能与真菌、苔藓、蕨类和种子植物共生，如念珠藻与真菌共生形成地衣（地木耳）。最简单的蓝细菌为杆状或球形的单细胞生物，多数则形成不分枝的丝状体，由许多单个细胞联成一串，并为一共同的胶质鞘套包被。蓝细菌主要进行分裂繁殖，单细胞蓝细菌分裂后形成群体，包围在胶质层内。丝状蓝细菌细胞在鞘内排成行，通过细胞分裂使菌丝加长，菌丝不分枝，但有时有假分枝。某些丝状蓝细菌能在丝状体中间或顶部产生异形胞，异形胞比营养体稍大，壁厚，两端有极节，只含有叶绿素a，是固氮蓝细菌固氮的场所。另一些蓝细菌可形成由营养细胞膨大、细胞壁加厚的厚垣孢子。在不良环境下，厚垣孢子可处于休眠状态，待环境适宜时，孢子再萌发成新菌丝。3、酵母菌课本48~51呈球状、卵圆状、椭圆状、柱状和香肠状，无性繁殖多营出牙方式。最典型和最重要的酵母菌为酿酒酵母，形态：球状、卵圆状或椭圆状。三、实验器材1、菌种：干地衣；酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）斜面菌种。2、器材：克氏培养基或麦氏培养基的试管斜面，载玻片、盖玻片、接种环、蒸馏水、滴管和显微镜。四、实验掌握要点1、显微镜的基本结构、原理、性能及使用方法。2、无菌操作技术。3、水浸片的制作。15 五、实验内容与操作：（一）实验内容1、显微镜的使用2、蓝细菌的形态观察3、酵母菌的形态观察（二）操作步骤1、显微镜的使用：先在低倍（10倍）下找到视野，再换高倍镜（40倍）观察，最后用油镜进一步观察绘图。使用完毕，用擦镜纸将油镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸少许二甲苯将镜头擦2～3次，最后将擦镜纸将镜头擦2～3次，将显微镜归还原处。2、蓝细菌的形态观察操作步骤（1）将干地衣用水浸泡24h，取菌液一滴，加入洁净载玻片上，盖上盖玻片。（2）镜检：先低倍、后高倍镜观察。3、酵母菌的形态观察操作步骤（1）酵母菌的培养：将酿酒酵母转接到马铃薯培养基斜面上，28℃培养2天。（2）制片与观察：加一滴蒸馏水于载玻片中央，挑取酵母菌培养体少许放入水滴中制成涂匀，盖上盖玻片。在显微镜下镜检，先低倍镜，后高倍镜。六、作业与思考题1、绘出所观察到的蓝细菌的形态图，标明营养细胞和异形胞。2、绘出所观察到的酵母菌的形态图，注明各部位的名称。15 实验三革兰氏（G）染色和细菌运动性观察（4学时p38～40，46～47）一、实验目的学习微生物涂片、革兰氏染色的基本技术，掌握细菌的革兰氏染色方法；初步认识细菌的形态特征；了解细菌运动性观察方法。二、实验原理革兰氏染色原理见p38。革兰氏染色法能将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，是世界上最常用的鉴别染色法。细菌运动性观察原理P46：细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。鞭毛是细菌的运动器官，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否具有鞭毛。悬滴法：将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，并倒盖在有凹槽的载玻片中央，放置光学显微镜下观察。水封片法：将菌液滴加在普通载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜下观察。大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛，如枯草芽孢杆菌；有的无鞭毛，弧菌和螺旋菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动性，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。三、主要实验器材1、活材料：培养16～18h的金黄色葡萄球菌，培养24h的大肠杆菌；培养12～16h的枯草杆菌。2、染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、番红、香柏油、二甲苯、凡士林。3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显微镜。四、实验掌握要点（1）革兰氏染色菌龄控制在18～24h，细菌运动性观察菌龄控制在12～16h。（2）染色时间和原理（3）细菌运动性的判断五、实验内容与操作：（一）实验内容15 1、细菌的革兰氏染色法P39～402、细菌的运动性观察p46～47（二）操作步骤1、细菌的革兰氏染色操作步骤（1）涂片：用记号笔在一洁净的载玻片上的左右两端标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片、干燥、固定。（2）初染：在水平位置上，将草酸铵结晶紫染液滴加在涂片上，染色1min，倾去染液，用流水冲洗至流下水呈无色为止。（3）媒染：用新配的卢哥氏碘液冲去涂面上的残水，再将涂面覆盖染色1min，水洗。（4）脱色：载玻片反面衬一白纸，手执载玻片使之倾斜，滴加95%乙醇进行脱色，当载玻片上流出的乙醇液中紫色接近消失时（20～30s）立即用自来水冲洗。（5）复染：去掉载玻片上的水珠，在涂面上滴加番红染色液，染色3～5min，水洗，吸水纸吸干。（6）镜检：用油镜观察革兰氏染色后的菌体形态及颜色。2、细菌的运动性观察——水封片法（1）滴加菌液：滴加一滴菌液于洁净的载玻片上，盖上盖玻片，用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。（2）镜检：先用低倍镜找到标记，再稍微移动即可找到菌液的边缘，将菌液移到视野中央换高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察细菌的运动性。细菌的运动：从一处游动至它处，可看到活跃的运动；布朗运动：仅在原处左右摆动。六、作业与思考题1、革兰氏染色中哪一步是关键？为什么？你如何控制这一步？2、绘出革兰氏染色的菌体形态图，并注明菌体颜色及反应性（阳性或阴性）。3、绘出所看到的细菌的形态图，并用箭头表示其运动方向。4、镜检时如何区别由鞭毛引起的细菌运动和布朗运动？15 实验四霉菌与放线菌的形态特征观察（4学时p51～52、50）一、实验目的学习自制水浸片观察霉菌、放线菌的形态，了解几类常见霉菌、放线菌的基本形态特征。二、实验原理霉菌营养体是分枝的丝状体。分基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中有可分化出繁殖菌丝，不同的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，故制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不宜干燥，能保持较长时间，溶液本身呈蓝色，有一定的染色效果。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多(约为3～10微米)，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。放线菌的孢子丝形状和孢子排列情况是放线菌分类的重要依据，为了不打乱孢子的排列情况，常用印片法进行制片观察。三、实验器材1、活材料：在马铃薯培养基上生长3～4天的根霉、青霉和米曲霉；在高氏一号培养基上生长的放线菌。2、染色液和试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液、50%酒精；石炭酸复红染色液。3、器材：剪刀、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、酒精灯、显微镜。四、实验掌握要点1、霉菌的水浸片制作2、放线菌的印片染色法五、实验内容与操作：（一）实验内容1、霉菌的形态观察（低倍镜）P51～52。2、放线菌的形态观察（油镜）P50。（二）操作步骤15 1、霉菌水浸片制作的操作步骤（1）制片：在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液或蒸馏水，用解剖针从平板上挑取少量带孢子的霉菌菌丝，用50%的乙醇浸润，再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下，然后放入载玻片的液滴中，用解剖针将菌丝分散开来。盖上盖玻片。（2）镜检：先用低倍镜，必要时转换高倍镜镜检，注意观察菌丝有无隔膜，有无假根、足细胞等特殊形态的菌丝及无性繁殖器官的性状、构造、孢子着生的方式、孢子的形态大小，并记录观察结果。2、放线菌印片染色的操作步骤（1）制片：用小刀窃取放线菌培养体一块（带培养基），放入洁净载玻片上，用另一载玻片对准菌块的气生菌丝轻轻按压，在将载玻片垂直拿起。勿使培养体在玻片上滑动，以免打乱孢子丝的自然形态。（2）固定：将印有放线菌的涂面朝上，通过酒精灯火焰2～3次加热固定。（3）染色：用石炭酸复红染色液染色1min。（4）水洗，晾干（不能用吸水纸吸干）。（5）镜检：先低倍镜，后高倍镜，再油镜观察孢子丝、孢子形态及排列。六、作业与思考题1、绘出根霉、青霉、曲霉的个体形态图，并注明各部位名称。2、绘出链霉菌的孢子丝和孢子的形态图。3、印片法成败关键在哪里？15 实验五纯系分离及无菌操作技术一、实验目的掌握无菌操作技术，学会食用菌的组织分离技术。二、实验原理　　用子实体的某一部分来分离菌种的方法，称为组织分离法。组织分离法简便，后代不易发生变异，能保持原菌株的优良特性。组织分离最好采用正处于旺盛生长中的幼嫩子实体或菇蕾作为分离材料，采取菌盖与菌柄交接处的组织进行分离，效果最好，对于那些有内或外菌幕保护的菇类来说，取在菌幕保护下的幼嫩菌褶接种，生活力更加旺盛。对于某些菌根菌，则取用靠近基部的菌柄组织才能成活。无菌操作技术：无菌室的设计、灭菌、检测和操作规则及接种工具准备等P105～108。接种方法P108～112。三、实验器材1、培养基：牛肉膏蛋白胨斜面，马铃薯斜面。2、器材：接种环、镊子、接种铲，70%酒精。四、实验内容1、食用菌外表消毒2、分离接种五、操作步骤1、表面消毒：将子实体（平菇）先经0.1%开汞水或70%酒精表面消毒后。用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。2、组织分离与接种：用无菌解剖刀自菌柄处切开少许，再用手将子实体掰开为二，在菌盖与菌褶交界处，切取0.3～0.4立方厘米的一小块菌肉，移放在斜面培养基中央。如已开伞的种菇、则选菌盖与菌柄交界处的菌肉。分离草菇时，用无菌解剖刀把菌蕾纵切少许；再用手把菌盖轻轻剥开，在菌柄上方和菌盖交界处，切取1～5毫米的细块，接在斜面培养基中央。3、培养：组织分离后将试管放在恒温箱中28℃培养。待组织块周围萌发出菌丝，并向培养基蔓延生长后，再挑取生长健壮的菌丝进行转管培养。六、作业：15 叙述组织分离的方法步骤，体会和注意事项，观察记载斜面菌落生长速度和成功率。15 实验六细胞大小测定及血球计数板技术（4学时p64～69）一、实验目的了解目镜测微尺、镜台测微尺和血球计数板的构造与使用原理，掌握测定微生物细胞大小和使用血球计数板进行微生物细胞计数的方法；增强对微生物细胞大小的感性认识。二、实验原理1、微生物细胞大小的测定P64：微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，微生物菌体微小，只能在显微镜下测量。测量工具—测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块圆形玻片，中央有精确的等分刻度，在5mm刻尺上等分50份。测量时，将其放在接目镜的隔板上用于测量经显微镜放大后的细胞物象。因不同目镜、物镜组合的放大倍数不同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，使用前必须用镜台测微尺进行标定。镜台测微尺是中央部分可有精确等分线的专用载玻片，一般将1mm等分为100格，每格长10μm，专门用来校正目镜测微尺每格长度的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，故用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的实际长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。2、显微镜直接计数法P67：适宜各种单细胞菌体的纯培养悬浮液。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（PetrofHausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板比较薄，可使用油镜观察。血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌难于区分。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，其上由4条平行槽构成的3个平台，中间的平台较宽，在其中间又被一条短槽隔成两半，每半平台上面各刻有一个方格网，为计数板的计数室。计数室的长和宽各为1mm，中间平台下陷0.1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1mm3。15 常用血球计数板的计数室有两种规格一种是16×25型，称麦氏血球计数板，共有16个大格，每个大格又有25个小格；二种是25×16型，称希里格式血球计数板，共有25大格（用双线分开），每个大格分成16小格。共同点：小格总数相同（400个小方格），体积相同（0.1mm3＝10－4mL）。计数与计算公式：16×25型：按计数板对角线方位，取左上、右上、左下、右下4大格（4×25＝100小格）内的细胞计数N，则每毫升菌液中所含有的酵母菌细胞数为：酵母菌细胞数（个/mL）＝100小格内酵母菌细胞数N/100×400×104×稀释倍数＝100小格内酵母菌细胞数N×4×104×稀释倍数25×16型：按计数板对角线方位，取左上、右上、左下、右下、中央共5大格（5×16＝80小格）细胞数N，则每毫升菌液中所含有的酵母菌细胞数为：酵母菌细胞数（个/mL）＝80小格内酵母菌细胞数N/80×400×104×稀释倍数＝80小格内酵母菌细胞数N×5×104×稀释倍数三、实验器材1、活材料：酿酒酵母斜面菌种或培养液。2、器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板、载玻片、盖玻片、滴管、擦镜纸。四、实验掌握要点1、目镜测微尺的原理及校正方法2、血球计数板技术原理五、实验操作步骤：（一）微生物细胞大小的测定1、目镜测微尺的标定旋开目镜的上透镜，将目镜测微尺轻轻地放入接目镜的隔板上，刻度面朝下。将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，刻度面朝上。15 先用低倍镜观察，对准焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行，并使两尺的左边的一条线重合，向右寻找另外两尺相重合的直线。记录两尺重合刻度间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。用公式计算：目镜测微尺每格长度（μm）＝10×目镜测微尺的格数/镜台测微尺的格数（两条重合线间）同样方法，分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。由于不同的显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的接物镜、接目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用。若更换目镜、物镜放大倍率时必须重新进行校正标定。2、微生物大小的测定（1）将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10－2）.（2）取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。（3）移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后的一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10～20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。待测微生物需用培养至对数生长期的菌体进行测定。（4）同法可用油镜测定细菌染色标本的细胞大小。（二）血球板计数1、制备菌悬液：根据菌液浓度，加无菌水适量稀释（斜面一般稀释到10－2），以每小格的菌数可数为度（每小格4～5个酵母细胞）。可滴入几滴甲醛杀死酵母菌，加几滴美蓝染色液，使酵母菌体着色。2、制片：先将盖玻片放在计数室上，用吸管吸取一滴已稀释好的菌液滴于盖玻片的边缘，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，用滤纸吸去多余菌液；稍待片刻，待酵母细胞全部沉降到计数室底部，再进行计数。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，再加盖玻片，镜检计数。3、镜检：将制成水浸片的血球计数板置于载物台上，先低倍镜观察到计数区，再转换高倍镜，将计数室一角的小方格移至视野中。4、计数：若16×25型血球计数板，则数4大格（100小方格）内酵母数；25×16型血球计数板，则数5大格（80小方格）内酵母数；计数时，如菌体位于大方格的双线上，则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。对于出芽酵母菌，当芽体达到母体细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2～3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作）。按公式计算出每mL（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。15 5、血球计数板的存放：测数完毕，立即取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用电吹风机吹干，放入盒内保存。六、作业与思考题1、将细胞大小测定实验结果填入表1、2中。表1目镜测微尺校正结果物镜倍数目尺格数台尺格数目尺校正值/μm10×40×100×表2酵母菌大小测定记录（格）123456789101112131415均值长宽结果计算长μm＝平均格数×校正值宽μm＝平均格数×校正值大小表示：宽μm×长μm2、将血球计数板计数实验结果填入下表3中表3酵母菌细胞数量的计数记录计数次数各大格中细胞数大格中细胞总数稀释倍数总菌数/（个/mL）g左上右上右下左下中间第一次第一次平均值3、试述血球计数板的计数原理。为什么用两种不同规格计数板来计数同一样品，结果相同？15 实验七微生物细胞的平板计数实验八大肠菌群的检测实验九土壤中微生物的分离实验十血型的测定15