微生物肥料实验用培养基技术条件nyt1114-2006

微生物肥料实验用培养基技术条件（NY/T1114-2006）1　范围本标准规定了微生物肥料实验室使用的培养基技术要求。本标准适用于微生物肥料产品质量检验、菌种培养与保藏用培养基的制备。2　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T19524.1-2004 肥料中粪大肠菌群的测定NY527-2002        光合细菌菌剂3　术语和定义培养基medium由人工配制的适合微生物生长、代谢、繁殖和保存的营养基质。4　培养基制备流程图（略）5　培养基选用原则5.1　含有满足所培养的微生物生长必需的营养物质。5.2　各种营养物质要有合适的比例和浓度。　5.3　有合适的pH范围和一定的缓冲pH能力。5.4　有一定的氧化还原电位和合适的渗透压。5.5　对于特殊用途的培养基，除遵循以上原则外，还应满足以下要求：5.5.1　在选择培养基中，应加入利于目的微生物生长而抑制其它微生物生长的化学物质。5.5.2　菌种保藏培养基选用原则5.5.2.1　对于产芽孢或孢子的菌种保藏培养基应以易产生芽孢或孢子为原则。 5.5.2.2　对于自养微生物的菌种保藏培养基应只使用无机盐类，不使用有机物。5.5.2.3　对能利用无机氮源的微生物，其菌种保藏培养基中不宜使用有机氮源。5.5.2.4　对营养缺陷型微生物，其菌种保藏培养基中必须含有该缺陷所需的物质。5.5.2.5　对耐某种药物的微生物，其菌种保藏培养基中应含有一定浓度的该种药物。6　要求6.1　材料6.1.1　用于配制培养基的化学试剂纯度至少为化学纯。6.1.2　试剂出现颜色改变、沉淀、混浊、吸潮结块的现象时，不宜使用。6.1.3　天然原材料应质量稳定，未发生霉变、生虫和变质。6.1.4　琼脂凝固后应具有良好的透明度。6.2　器皿6.2.1　配制试剂所用的器皿应洁净。6.2.2　盛装培养基的器皿应由对微生物无毒害并耐高温的材料制成。6.2.3　材料需加热溶解时，可选用玻璃容器、搪瓷缸和不锈钢容器等，禁用铜制、铝制和铁制容器。6.3　棉塞或硅胶塞6.3.1　不应使用脱脂棉制作棉塞。6.3.2　使用棉塞或硅胶塞时，将其长度的2/3塞入容器内。要求松紧适当，紧贴管壁。6.3.3　灭菌时，棉塞外要加包牛皮纸或耐高温透气塑料薄膜，以防止灭菌时棉塞受潮或进水。6.4　培养基配制6.4.1　材料称量6.4.1.1　根据培养基配方，准确称取相应材料的量。 6.4.1.2　当配方中某种成分微量时，可预先将该成分配制成一定浓度的母液，然后按量加入。母液须低温保存。6.4.2　材料溶解6.4.2.1　不溶于水的组分应在所需的溶剂中溶解后，再加入到培养基中。6.4.2.2　非溶性组分，如CaCO3,应最后加入。6.4.2.3　易形成沉淀的组分应分别溶解。6.4.2.4　不易溶解的组分应做预处理。加热溶解过程中一旦出现焦化现象时应弃用。6.4.2.5　培养基中含有指示剂或有颜色的试剂时，应在培养基pH调节好之后再加入。6.4.3　pH测定与调节6.4.3.1　用精密pH试纸或酸度计测定培养基的pH。6.4.3.2　培养基的pH用稀酸或稀碱溶液调节。调节过程中不可用酸碱溶液反复调节。6.4.4　分装装入三角瓶的培养基体积不应超过其容量的1/2，装入试管的培养基体积为其容量的1/4～1/5。分装过程中防止培养基粘附在瓶口或管口。6.4.5　灭菌6.4.5.1　高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌控制的条件为121℃、维持30min。当培养基中含有不耐高温的组分时，可采用115℃、维持15min～30min。6.4.5.2　过滤除菌在无菌条件下，将待除菌溶液经滤膜为φ≦0.2μm的细菌过滤器，达到除菌的目的。适用于易受高温破坏、失活的物质的灭菌，如维生素。6.4.5.3　干热灭菌将待灭菌的器皿，用纸包好或放在特定的容器内，置于烘箱中，在160℃左右保持2h。适用于培养皿等玻璃器皿的灭菌。 6.4.6　平板和斜面的制备在无菌条件下把冷却至45℃左右的培养基倒入无菌培养皿内，平板厚度范围控制在3mm～5mm。制备的斜面长度不超过试管长度的2/5。6.5　培养基合格检验6.5.1　检查固体培养基湿度。培养基冷凝水过多或干燥出现裂痕时，均不能使用。6.5.2　随机抽取已灭过菌的培养基放入28℃～30℃培养箱中培养24h～48h，确定无菌生长后方可使用。6.6　培养基存放培养基应放在冰箱4℃～8℃保存。经过存放的培养基使用前应进行6.5的合格检验，合格后方可使用。7　微生物肥料常用培养基配方、配制要点和用途微生物肥料常用培养基配方、配制要点和用途参见附录A。 　附　录　A（规范性附录）　常用培养基配方A.1　营养琼脂A.1.1　成分蛋白胨                                     10.0g牛肉膏                                     3.0g氯化钠(NaCl)                               5.0g琼脂                                       18.0g蒸馏水                                     1000mLpH                                        7.2～7.5A.1.2　配制要点将各种成分溶解于蒸馏水内，调节pH，再加琼脂，加热溶化后分装。121℃高压灭菌30min。A.1.3　用途适用于一般细菌培养和保藏。A.2　芽孢杆菌培养基A.2.1　成分蛋白胨                                     5.0g牛肉膏                                     3.0g土壤浸出液                                 250mL蒸馏水                                    750mL琼脂                                       18.0gA.2.2　配制要点 土壤浸取液：土壤50g，加水200mL，121℃灭菌1h，过滤补水至250mL。其他同A.1.2A.2.3　用途适用于芽孢杆菌的保藏。A.3　阿须贝氏（Ashby）培养基A.3.1　成分磷酸二氢钾(KH2PO4)                          0.2g硫酸镁(MgSO4·7H2O)                         0.2g氯化钠(NaCl)                               0.2g碳酸钙(CaCO3)                              5.0g甘露醇(C6H14O6)                              10.0g硫酸钙(CaSO4·2H2O)               　　　   0.1g琼脂                                       18.0g蒸馏水                                     1000mLpH                                         6.8～7.0A.3.2　配制要点同A.1.2A.3.3　用途用于固氮菌的培养。A.4　根瘤菌培养基YMA.4.1　成分磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)                    0.5g硫酸镁(MgSO4·7H2O)                         0.2g氯化钠(NaCl)                               0.1g 甘露醇(C6H14O6)                              10.0g酵母膏                                     1.0g0.5%刚果红溶液                             5mL琼脂                                       18.0g蒸馏水                                    1000mLpH                                         6.8～7.0A.4.2　配制要点将各种营养成分溶解于蒸馏水内，调节pH后，加入刚果红溶液。再加琼脂，加热溶化后分装。121℃高压灭菌30min。A.4.3　用途适用于根瘤菌的培养。A.5　根瘤菌培养基=2*ROMANIIA.5.1　成分酵母粉                                     1.0g甘露醇(C6H14O6)                              10.0g土壤浸出液                                 200mL琼脂                                       15.0g蒸馏水                                     800mLpH                                         7.2A.5.2　配制要点土壤浸出液：土壤50g，加水200mL，121℃灭菌1h，过滤补水至200mL。其他同A.1.2A.5.3　用途适用于根瘤菌的保藏和培养。 A.6　硅酸盐细菌培养基A.6.1　成分蔗糖（C12H22O11）                             5.0g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)                  2.0g硫酸镁(MgSO4·7H2O)                         0.5g碳酸钙(CaCO3)                              0.1g三氯化铁(FeCl3·6H2O)                       0.005g琼脂                                       18.0g蒸馏水                                     1000mLpH                                         7.5～8.0A.6.2　配制要点先将三氯化铁配制成5‰的溶液，按量加入，其他同A.1.2A.6.3　用途适用于硅酸盐细菌的培养。A.7　固氮（茎瘤）根瘤菌培养基A.7.1　成分乳酸钠（C3H5O3Na）                          10.0g磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)                    1.67g磷酸二氢钾(KH2PO4)                          0.87g氯化钠(NaCl)                               0.05g氯化钙(CaCl2)                              0.04g三氯化铁(FeCl3·6H2O)                       0.004g硫酸镁(MgSO4·7H2O)                         0.1g酵母膏                                     1.0g 琼脂                                       18.0g蒸馏水                                     1000mLpH                                         6.8～7.0A.7.2　配制要点先将三氯化铁配制成4‰的溶液按量加入，其他同A.1.2。A.7.3　用途适用于茎瘤根瘤菌的培养。A.8　马丁培养基A.8.1　成分磷酸二氢钾(KH2PO4)                          1.0g葡萄糖(C6H12O6·H2O)                         10.0g硫酸镁(MgSO4·7H2O)                         0.5g蛋白胨                                     5.0g1%孟加拉红水溶液                           3.3mL氯霉素                                     0.1g琼脂                                       18.0g蒸馏水                                     1000mLA.8.2　配制要点将营养成分用蒸馏水溶解后，按量加入1%孟加拉红水溶液，氯霉素先用少量乙醇溶解后加到培养基中。再加琼脂，加热溶化后分装。115℃高压灭菌20min。A.8.3　用途适用于真菌的培养。A.9　高氏合成一号琼脂 A.9.1　成分硝酸钾(KNO3)                               1.0g磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)                    0.5g硫酸镁(MgSO4·7H2O)                         0.5g氯化钠(NaCl)                               0.5g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)                       0.01g可溶性淀粉(C6H10O5)n                         20.0g重铬酸钾（K2Cr2O7）                         0.1g琼脂                                       18.0g蒸馏水                                 　　1000mLpH                                         7.2～7.4A.9.2　配制要点淀粉用少量冷水调成糊状,加热溶解后加入。再加琼脂，加热溶化后分装，121℃高压灭菌30min。重铬酸钾配制成溶液单独灭菌，使用时再加入到培养基中。A.9.3　用途适用于放线菌的培养。A.10　联合固氮菌培养基A.10.1　成分D-葡萄糖酸钠(C6H10NaO7)                    5.0g磷酸二氢钾(KH2PO4)                          0.4g磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)                    0.1g硫酸镁(MgSO4·7H2O)                         0.2g酵母膏                                     1.0g氯化钠(NaCl)                               0.1g 氯化钙(CaCl2)                              0.02g三氯化铁(FeCl3·6H2O)                       0.01g钼酸钠（Na2MoO4）                           0.002g琼脂                                       18.0g蒸馏水                                     1000mLpH                                         6.8～7.0A.10.2　配制要点将氯化钙配、钼酸钠分别配制成2‰的溶液，按量加入，其他同A.1.2。A.10.3　用途适用于固氮螺菌的培养。A.11　马铃薯葡萄糖琼脂培养基A.11.1　成分马铃薯                                     200g葡萄糖(C6H12O6·H2O)                         20.0g琼脂                                       18.0g蒸馏水                                     1000mLA.11.2　配制要点称取去皮马铃薯200g切块，放入水中煮沸30min，然后用双层纱布过滤取汁，再加葡萄糖和琼脂，溶化后补足水至1000mL，115℃灭菌20min。A.11.3　用途适用于酵母菌的培养。A.12　麦芽汁琼脂A.12.1　成分12波林麦芽汁（Brix）                       1000mL 琼脂                                      18.0gpH                                         5.4A.12.2　配制要点将麦芽汁调至12波林的糖度，调节pH，加入琼脂，加热溶化后分装。115℃高压灭菌20min。A.12.3　用途适用于酵母菌的培养和保藏。A.13　乳酸细菌培养基（MRS）A.13.1　成分蛋白胨                                     10.0g牛肉膏                                     10.0g酵母膏                                     5.0g柠檬酸氢二铵[(NH4)2C6H6O7]                       2.0g葡萄糖(C6H12O6·H2O)                         20.0g吐温80                                     1.0g乙酸钠（CH3COONa·3H2O）                    5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)                    2.0g硫酸镁(MgSO4·7H2O)                         0.58g硫酸锰(MnSO4·H2O)                         0.25g琼脂                                       18.0g蒸馏水                                     1000mLpH                                         6.2～6.6A.13.2　配制要点 将各种成分溶解于蒸馏水内，调节pH，再加琼脂，加热溶化后分装。121℃高压灭菌20min。A.13.3　用途适用于乳酸菌的培养。A.14　光合细菌培养基=1*ROMANIA.14.1　成分酵母粉                                     3.0g蛋白胨                                     3.0g硫酸镁(MgSO4·7H2O)                         0.5g氯化钙（CaCl2）                            0.3g蒸馏水                                     1000mLpH                                         6.8～7.0A.14.2　配制要点同A.1.2。A.14.3　用途适用于光合细菌的培养。 A.15　光合细菌培养基=2*ROMANIIA.15.1　成分；溶液=1*ROMANI氯化钙（CaCl2）                            75mg乙酸钠（CH3COONa）                        1.6g烟酸                                       40mg氯化钠(NaCl)                               1.5g 生物素                                     40mg酵母膏                                     2.0g硫胺素                                     40mg氯化镁(MgCl2)                              200mg乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）溶液              5mL微量元素溶液                               1mL蒸馏水                                     800mL溶液=2*ROMANII磷酸二氢钾(KH2PO4)                          600mg磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)                    1.18g蒸馏水                                     200mL将溶液=1*ROMANI、溶液=2*ROMANII分别于121℃高压灭菌15min，冷却后将溶液=1*ROMANI、溶液=2*ROMANII混匀。微量元素溶液：乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2O8·2H2O）       2.0g硼酸（H3BO3）                               100mg氯化锌（ZnCl2）                            100mg高钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）                   20mg氯化铜（CuCl2）                            10mg硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)                       2.0g氯化钴（CoCl2·6H2O）                      100mg氯化锰（MnCl2·4H2O）                       100mg氯化镍（NiCl2·6H2O）                       20mg亚硒酸钠（Na2SeO3）                                            1mg 蒸馏水                                   1000mL乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）溶液:乙二胺四乙酸铁（EDTA-Na2）                 20.0g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)                       20.0g蒸馏水                                     1000mLA.15.2　配制要点乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）溶液需要通气过夜，维生素类物质要过滤除菌后按量加入到培养基中。。A.15.3　用途适用于光合细菌的培养。A.16　乳糖胆盐发酵培养基(用于大肠菌群初步发酵)A.16.1　成分蛋白胨                                     20.0g   猪胆盐                                     5.0g   乳糖                                       10.0g0.04%溴甲酚紫溶液                          25.0mL   蒸馏水                                     1000mL   pH                                         7.2～7.4A.16.2　配制要点将各种成分溶解于蒸馏水内，调节pH，然后加入溴甲酚紫溶液，分装到试管中，并放入小倒管。115℃高压灭菌15min。A.16.3　用途用于乳糖发酵实验。A.17　伊红美蓝琼脂 A.17.1　成分蛋白胨                                     10.0g   乳糖                                       10.0g   磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)                    2.0g   2%伊红水溶液                               20.0mL0.65%美蓝水溶液                           10.0mL   琼脂                                       20.0g   蒸馏水                                     1000mLpH                                         7..2～7.4A.17.2　配制要点将蛋白胨、乳糖、磷酸盐溶解于蒸馏水内，调节pH，加入琼脂，加热溶解，分装。115℃高压灭菌15min备用。伊红和美蓝溶液分别在121℃下高压灭菌20min。使用时加入已灭菌的伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。A.17.3　用途用于大肠菌群的分离培养。A.18　乳糖发酵培养基A.18.1　成分蛋白胨                                     20.0g   乳糖                                       10.0g   0.04%溴甲酚紫溶液                          25.0mL   蒸馏水                                     1000mLpH                                         7.2～7.4A.18.2　配制要点将各种营养成分溶解于蒸馏水内，调节pH，然后加入溴甲酚紫溶液，分装至试管，并放入小倒管。115℃高压灭菌15min。 A.18.3　用途用于大肠菌群验证实验。