猪细小病毒分子生物学诊断技术的研究进展

猪细小病毒分子生物学诊断技术的研究进展芜湖职业技术学院2010年第12卷第4期猪细小病毒分子生物学诊断技术的研究进展季慕寅(芜湖职业技术学院生物系,安徽芜湖,241000)摘要:猪细小病毒是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一.它广泛分布于世界各地,给我国乃至全世界的养猪业造成了巨大的经济损失.近年来,猪细小病毒的分子生物学诊断方法的研究进展迅速,为猪细小病毒的快速,准确的诊断起到了重要的作用.从聚合酶链式反应技术,核酸探针技术,DNA芯片技术等方面对猪细小病毒的分子生物学诊断技术进行综述有助于我们进一步了解这项技术关键词:猪细小病毒;分子生物学诊断;聚合酶链式反应;核酸探针技术;DNA芯片技术.中图分类号:$852.6;文献标识码:A;文章编号:1009.1114(2010)04.0027.03CurrentsituationofMolecularBiologyDiagnosisforPorcineParvovirusJIMu-yinAbstract:Porcineparvovirus(PPV)isoneofmajorcausativeagentswhichresultsinasyndromeofreproductivefailureinswine.Itsinfectionhasbecomeaworld—wideproblemandcausesagreateconomiclossinpig—breedingindustryinChina.Atpresent,withtherapiddevelopment,molecularbiologydiagnosishasbeenwidelyusedandplayedanimportantroleinthediagnosisofPPV.TosummarizethemolecularbiologydiagnosistechnologyforPPVfromPolymerasechainreactiontechnology,nucleicacidprobetechnologyandgenechiptechnologyishelpfultofurtherourcomprehensionforit. Keywords:porcineparvovirus(PPV);molecularbiologydiagnosis;polymerasechainreaction(PCR);nucleicacidprobe;genechip.收稿日期:2010.09.20作者简介:季慕寅,1974年出生,安徽无为人,南京农业大学预防兽医学专业学位研究生,讲师.猪细小病毒(porcineparvovirus,PPV)是细小病毒科细小病毒属成员,是一种自主复制型病毒.它的感染主要引起母猪繁殖障碍,尤其是初产母猪和血清学阴性的经产母猪的胚胎和胎儿的感染和死亡,导致母猪流产,不孕,产死胎,畸形胎,木乃伊胎及弱仔等.该病在世界范围内广泛分布并在大多数猪场呈现地方性流行得趋势,给养猪业带来了巨大的经济损失.此外,有学者指出,PPV和猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2,PCV2)协同感染是导致断奶仔猪多系统衰竭征(PostweaningMultisystemicWastingSyndrome,,PMWS)的主要原因.因此,对PPV进行快速,准确的诊断有着重要的临床意义.目前,常用的PPV诊断方法有病毒学检测,血凝试验(HA)和荧光抗体技术.这些技术特异性不强,敏感性业较低.近几年来,随着分子生物学的飞速发展,快速,高敏感性和特异性的分子生物学诊断技术在PPV诊断中得到了充分的发展.以下从PCR检测技术,核酸探针技术,DNA芯片技术等方面对PPV的分子生物学诊断技术进行了综述.1.聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术1.1.常规PCR自1985年Mullis发明PCR技术以来,PCR作为一种快速,高效,敏感性高,特异性强的技术已经被广泛地运用于27病原微生物的诊断.此法率先运用PCR技术检测了PPV. 根据2株PPV经典分离株NADL一8和NADL.2的DNA序列,科研人员设计了一对针对结构基因VP2的引物,扩增出158bp的核酸片段.该方法敏感性可达到1PFU的细胞感染量,并且在伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus,PRV),犬细小病毒(canineparvovirus)等中未出现特异性条带,说明其具有较高的敏感性和特异性.参照上述方法人们利用相同的引物,成功地建立PPVPCR检测方法,并将其运用于临床.在对26份临床采集的自然感染猪样品中,PPVPCR方法的阳性检出率最高,其敏感性依次高于HAT,间接斑点ELISA,双夹心ELISA和免疫金银染色法(IGSS).科研人员在前人的基础上,重新设计了针对VP2基因的一对引物,成功地从PPV感染的组织和细胞中扩增出882bp的目的片段.李文刚以16个核苷酸引物首次完成了PPVDNA结构蛋白VPI编码区228bp片段的扩增.科研人员除了将引物选择在PPV结构基因区域外,还在PPV的非结构基因NS.I的保守区设计了引物,用来鉴别PPV感染的细胞和组织.结果表明,其敏感性是HA的106倍.1.2.套式PCR(nested-PCR)nested.PCR是利用两对PCR引物扩增目的片段的方法,它利用第一对引物扩增l5.3O个循环,再用第一次扩增的DNA片段内设定的第二对引物扩增15.30个循环.该方法比季慕寅:猪细小病毒分子生物学诊断技术的研究进展常规PCR方法更加特异.并且当样品内病原微生物含量极微量时,使用常规PCR不一定能检测,但是套式PCR可以克服该问题,进行更加微量的DNA检测.王汉中从PPVVP2基因上,选择两对引物进行了套式PCR,结果显示该方法可以检测到1TCID50的病毒量.Grigori等将nested-PCR和LightCycler技术相结合,建立了一种新的PPV定量检测方法,具有更好的特异性和敏感性. 1I3.多重PCR(Multi.PCR)Multi.PCR又称复合PCR,是在一个反应体系中加入多对引物或多个目的基因同时进行扩增的试验方法.它能够捕获更多的基因信息,使应用范围更加广泛,分析的基因也更加的复杂,因此,它适用于临床大量样品中多种病原微生物的检查.目前,PPV与猪主要病原微生物,如PCV,PRV,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等的混合感染愈发严重.国内外学者已经建立了同时检测PPV和猪其它重大疫病的Multi.PCR方法.利用两对特异性引物同时扩增出PPVVP2基因330bp和PCV2ORF2基因s47bp的目的片段,为临床快速准确检测PPV和PCV的混合感染建立了方法.T.Opriessning等利用已经建立的二重PCR方法,研究了PPV疫苗在PPV和PCV2共同感染的早期断奶仔猪发展为PMWS过程中的作用.国内学者分别针对PPVNS.1基因,PCV2ORF2基因,PRRSVMN基因和PRVgB基因设计了4对特异性引物,分别扩增出27lbp,353bp,434bp和194bp的片段,建立了PPV,PCV,PRRSV和PRV四重PCR检测方法.他们通过人为混合四种病毒的方式对该方法的特异性和敏感性进行了检测,结果表明该多重PCR对PPV的最低检测量为8.64x1031xg,对PCV2的最低检测量为2.90x10.4p.g,对PRRSV的最低检测量为3.68×10.3g,对PRV的最低检测量为2.36x10.3烬,且未有非特异性的扩增.多重PCR和多重反转录PCR可以对猪的主要病原微生物进行区分,包括PCV2,猪疱疹病毒,PPV,PRRSV,流行性乙型脑炎病毒(腰V),呼肠孤病毒,流行性腹泻病毒,传染性胃肠炎病毒等.1.4.荧光定量PCR荧光定量PCR技术以其高灵敏度,高特异性,便捷快速等优点在病原体的定性和定量方面得到了广泛应用.李明风 利用PCR技术扩增出PPVVP2基因保守区194bp片段,并克隆到pGEMT载体上,以lO倍梯度稀释纯化后的质粒作为标准模板,进行SYBRGreenI荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了PPV的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.0x102拷贝/L,并且与?RRSV,PCV2,JEV,PRV,猪瘟病毒(CSFV)和猪流感病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.研究人员将基于SYBRGreenIRea1.TimePCR与常规PCR相比,发现其敏感性提高了100倍.SYBRGreenI法是荧光定量PCR的模式之一,它还有水解探针模式(TaqMan).因为TagMan检测模式采用的是特异性引物,而SYBRGreenI检测模式采用的是通用引物,对非特异性28扩增或引物二聚体也会产生荧光,因此TagMan检测模式的敏感性高于SYBRGreenl检测模式.根据PPVVP2基因序列,有学者合成了一_×lj特异性引物和一条相应的TagMan探针,建立了PPVTagMan实时荧光定量PCR方法,并运用该法对临床来自各地的80头猪流产胎儿的心,肝,脾等组织样品进行了检测.结果显示该方法具有更高的检出率,能在HA和常规PCR判为阴性的样品中检测出PPV,灵敏度达到1.12TCID50/mL.随着荧光探针技术的广泛应用和科学技术的发展,科研人员以TaqMan探针定量PCR为基础发展多种改良的实时定量PCR新技术,主要有TaqMan.GBM技术,Moleularbeaeon技术,LightCycler技术,复合探针技术,UT-PCR技等.Moleularbeaeon技术又称分子信标技术,McKillen[19]运用该技术对PPV,PRV,亚洲猪瘟病毒和PCV2进行了快速的鉴别,可以检测到2x101的拷贝数.2.核酸探针技术核酸探针技术是在分子标记的基础}二,对已知序列的核酸标记上同位素,地高辛,生物素等,制成探针,并根据碱 基配对原则使模板核酸与探针反应,利用酶底物反应或放射自显影法观察是否出现预期的条带或斑点,从而做出准确诊断的方法.该方法敏感性高,特异性强,方便快捷,可以从混合标本中正确鉴定出目的病原微生物.1988年,核酸探针技术首先被运用于PPV的诊断,用32P标记的探针检测细胞培养物中的PPV,最低可检出O.1pg的DNA,其敏感度是HA的100倍.Waldvogel等以NADL.2型PPV毒株为模板扩增出3Kb的DNA片段,将此片段连到载体pUC.19后用大肠杆菌JM109进行转化,将用生物素标记RsaI酶切重组载体后的目的片段作为探针,与感染了PPV的胎儿样品进行原位杂交试验.科研人员将光生物素标记DNA和RNA的非放射性探针技术与放射性同位素32P标记以及其他非放射性标记方法进行比较,结果表明,利用生物素标记的探针进行杂交,克服了放射性同位素标记的许多缺点,具有快速,可靠,安全和价格低等优点.同时,我们用地高辛标记制备了NS.1基因PCR产物探针和克隆NS1探针,并对其进行了特异性和敏感性检测.结果表明两对探针均能与PPVDNA发生特异性的杂交,而与对照的PRV,PCV,PRRSV和HCV的核酸杂交呈阴性.此外,这种探针具有较高的敏感度,克隆NS.1探针敏感度为0.5pg/,NS一1基因PCR产物探针敏感度为1pg/~L.3.DNA芯片技术DNA芯片又被称为基因芯片或微阵列,属于生物芯片的一种,它是在核酸杂交与测序的基础上发展起来的.它的出现使在保持基因序列的特异性的条件下快速鉴别大量基因序列成为了可能.随着技术和设备的日趋成熟,成熟的商品化芯片口益增多,并且国外已有将其用于动物传染病诊断的报道.研究人员构建了检测PPV和CSFV的检测基因芯片.他们克隆了CSFV和PPV基因保守序列,提取质粒中的模板, 将其扩增纯化后作为探针,应用微量点样技术将探针固定在芜湖职业技术学院2010年第12卷第4期硝酸纤维素膜上,制备诊断基因芯片;然后将提取的样品核酸PCR扩增并用生物素标记后与诊断基因芯片进行特异性逆向点杂交,最后通过芯片扫描来实现对病原的高效检测和分析判断.张焕荣构建了PRV,PPV和JEV的检测基因芯片,并利用该构建的芯片检测了8株PRV,5株PPV和1株JEV,检测结果均为阳性.此外,利用该基因芯片检测PRV缺失株,结果为阴性.结果说明该构建芯片不仅能同时同时检测PRV,PPV和JEV,还能区别PRV的强弱毒株和基因缺失株.4.环介导的等温扩增反应(1oop.mediatedisothermalamplification,LAMP)LAMP由日本学者于2000年建立.它利用两至三对引物(包括一对外部引物,一对内部引物和一对环引物)和链置换DNA聚合酶,在等温条件下,几十分钟就可扩增出靶序列.该方法用时短,对设备要求低,且比普通PCR的敏感性高,非常适合于基层和现场操作使用.目前已有学者将该技术运用到PPV的检测中,根据PPVVP2区域设计了一套4条引物,利用LAMP在62"C的恒温条件下快速鉴别PPV,其敏感度可以达到5拷贝数,并且无非特异性扩增.利用该法检测125分临床样品,PPV检出率为97.6%,高于常规PCR.刘业兵等利用LAMPRealTimeTurbidimeterLA32029仪对PPVLAMP过程进行了实时分析,筛选出可靠,最佳的反应体系,建立了PPV的快速,特异的LAMP检测方法.同时,在LAMP反应结束后,他们在反应体系中加入SYBRGreenI,并将染色后肉眼观察的结果与LAMPRealTimeTurbidimeterLA.320仪的检测结果进行对比,发现结果一致, 这就为PPV诊断的现场操作和快速诊断奠定了基础.文稿责编张玮参考文献【1]李文刚,甘孟侯.聚合酶链式反应检测猪细小病毒的研究[J].中国兽医杂志,1996,22(8):3—5.【2]王汉中,梁莉.应用套式PCR检测猪细小病毒[J】.病毒,1996,12(2):177—182.【3]Kim,C.Choi,D.U.Han,eta1.Simultaneousdetectionofporcinecircovirustype2andporcineparvovirusinpigswithPMWSbymultiplexPCR[J].VeterinaryRecord,2001,149:304—305.[4】李明凤,魏战勇,王学斌等.猪细小病毒SYBRGreenI实时定量PCR检测方法的建立[J].浙江农业,2009,21(3):220—224.【5】刘业兵,张磊等.猪细小病毒LAMP检测方法的建立[J].中国农业科学,2010,43(14):3012—3018.