现代工业微生物育种技术研究进展

现代工业微生物育种技术研究进展生命科学仪器2009第7卷门2月干l综述现代工业微生物育种技术研究进展孟甜李玉锋★(西华大学生物工程学院,四川成都,61O039)摘要工业微生物的育种是现代工业发展的一个关键环节.本文介绍了现代工业微生物育种技术发展,包括自然育种,诱变育种,代谢控制育种,基因程育种等,并对育种技术的发展做了展望.关键词工业微生物;育种技术现代生物技术特别是发酵工程技术的最终产品,一般都是经过工业微生物这一"工厂"生产得到的,已经取得了举世瞩目的经济效益和社会效益.据统计,1979年世界工业酶产量为53000吨,1985年酶制剂的总产量为10万吨,作为商品出售的酶制剂有200余种,到1990年总产值约为10亿美.就生物技术而言,1991年美国,德国,法国和英国的总销售额依次为400,200,150,6.4亿美元[".对工业微生物菌种的优化选育是提高产量和质量的一条有效途径.以突变和筛选为中心的传统育种技术在工业微生物发展到现在规模的过程中始终起着重要作用.70年代以来,重组DNA技术和原生质体融合技术开始用于菌种选育.各种外源基因在原核生物,真核细胞的克隆和表达研究取得了重大成果,使工业微生物育种技术进入了真正意义的分子水平育种时代.1工业微生物育种的方法 1.1自然选育通过自然发生的突变和筛选法,筛选那些含有所需性状得到改良的菌种.随着富集筛选技术的不断完善和改进,自然育种技术的效率有所提高,如含有突变基因naE,mutD,mutT,mutM,mutH,mutI等的大肠杆菌突变率相对较高.酒精发酵是最早把微生物遗传学原理应用于微生物育种实践而提高发酵产物水平的一个成功实例_2_.自然选育是一种简单易行的选育方法,可以达到纯化菌种,防止菌种退化,提高产量的目的,但发生自然突变的几率特别低,一般为l0～～l0./BP.这样低的突变率导致自然选育耗时长,工作量大,影响了育种工作效率,在这种情况下,出现了诱变育种技术.1.2诱变育种1927年Miller发现x射线能诱发果蝇基因突变.之后人们发现其他一些因素也能诱发基因突变,并逐渐弄清了一些诱变发生的机理,为工业微生物诱变育种提供了前提条件.1941年Beadle和Tatum采用x射线和紫外线诱变红色面包霉,得到了各种代谢障碍的突变株.这之后诱变育种得到了极大发展.诱变育种是以诱变剂诱发微生物基因突变,通过筛选突变体,寻找正向突变菌株的一种诱变方法.诱变剂有物理诱变剂,化学诱变剂和生物诱变剂.1.2.1物理因子诱变物理诱变剂包括紫外线,x射线,^y射线,激光,低能离子等.DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力,最大的吸收峰在260nm,紫外辐射能作用于 DNA,因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂.紫外辐射可以引起转换,颠换,移码突变或缺失等.紫外线是常用的物理诱变因子,是诱发微生物突变的一种非常有用的工具.由于紫外线的能量tLx射线和^y射线低得多,在核酸中能造成比较单一的损伤,所以在DNA的损伤与修复的研究中,紫外线也具有一定的重要性.常用的电离辐射有x射线,^y射线,B射线和快中子等.如射线具有很高的能量,能产生电离作用,因而直接或间接地改变DNA结构;电离辐射还能引起染色体畸变,发生染色体断裂,形成染色体结构的缺失,易位和倒位等.低能离子注入育种技术是近些年发展起来的物理诱变技术.该技术既以较小的生理损伤而得到较高的突变率,较广的突变谱,而且具有设备简单,成本低廉,应运行和维修,对人体和环境无害等优点.作者简介:孟甜(1985一),女,硕士,研究方向:食品技术,E—mail:mengtian85@sobU.com通讯作者:李玉锋(I965～),男,教授,研究生导师,E～mail:yf—lilO@yahoo.com.cn3综述最近几年,低能离子用于微生物诱变育种研究也取得可喜成绩.目前利用离子注入进行微生物菌种选育时所选用的离子大多为气体单质离子,并且均为正离子,其中以N为最多,也有报道使用其他离子的,如H,Ar,O以及c.辐射能量大多集中在低能量辐射区[5].阮丽娟等(1993年)用低能离子注入糖化酶生产菌,仅仅经过l～2年时间,糖化酶生产菌活力已从平均发酵1.5万单位提高到2万单位,最高一株 达2.6万单位L61.除此之外,还有微波,双向复合磁场,红外射线和高能电子流等新诱变技术,它们与其他诱变源一起进行复合诱变,能起到很好的诱变效果,因此从某种意义上称这些诱变源为"增变剂"l7l.1.2.2化学因子诱变化学诱变剂是一类能与DNA起作用而改变其结构,并引起DNA变异的物质.其作用机制都是与DNA起化学作用,从而引起遗传物质的改变.化学诱变剂包括烷化剂如甲基磺酸乙酯,硫酸二乙酯,亚硝基胍,亚硝基乙基脲,乙烯亚胺及氮芥等,天然碱基类似物,脱氨剂如亚硝酸,移码诱变剂,羟化剂和金属盐类如氯化锂及硫酸锰等.烷化剂是最有效,也是用得最广泛的化学诱变剂之一,依靠其诱发的突变主要是GC—AT转换,另外还有小范围切除,移码突变及GC对的缺失.化学诱变剂的突变率通常要比电离辐射的高,并且十分经济,但这些物质大多是致癌剂,使用时必须十分谨慎.1.2_3生物因子诱变生物诱变剂应用面比较窄,因此应用受到了限制.1.2.4复合因子诱变与新型诱变剂某一菌株长期使用诱变剂之后,除产生诱变剂"疲劳效应"外,还会引起菌种生长周期延长,孢子量减少,代谢减慢等,这对生产不利,在实际生产中多采用几种诱变剂复合处理,交叉使用的方法进行菌株诱变[.复合诱变是指两种或多种诱变剂的先后使用,同一种诱变剂的重复作用,两种或多种诱变荆的 同时使用等诱变方法.普遍认为,复合诱变具有协同效应.如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用,复合诱变较单一诱变效果好.近年来,一些新型诱变剂被开发出来,并被证明有良好的效果.1996年,离子束诱变用于右旋糖酐产生菌,得到产量提高36.5%的突变株;1999年N激生命科学仪器2009第7卷门2月刊光辐照谷氨酸产生菌一钝齿棒状杆菌,谷氨酸产量和糖酸转化率比对照提高31%;此外,用红外射线诱变果胶酶产生菌,双向磁场应用于产腈水合酶的诺卡氏菌种的诱变育种都得到了较好效果.1.3基因重组基因重组是遗传的基本现象之一,菌株能够经过基因重组获得新的遗传型,从而获得具有优良性状的菌种.基因重组是杂交育种的理论基础,由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本,所以不论是方向性还是自觉性,都比诱变育种前进了一大步.1.3.1杂交育种杂交育种往往可以消除某一菌株在诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象,因而是一种重要的育种手段.但杂交育种方法较复杂,许多工业微生物有性世代不十分清楚,故没有像诱变育种那样得到普遍推广和使用.1.3-2原生质体融合育种在工业微生物育种中,应用转化,转导或接合等重组技术来培育应用于生产实践中的高产菌株的例子还不多见,只是在1978年第二届国际工业微生物遗传学讨论会上提出了原生质体融合后,重组育种技术 才获得了飞速的发展.原生质体融合技术由于可在种内,种间甚至属间进行,不受亲缘关系的影响,遗传信息传递量大,不需了解双亲详细的遗传背景,因而便于操作.该技术起源于1960年,当时法国Barski研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现自发融合现象;1978年国际工业微生物遗传学讨论会提出了原生质体的融合问题,使这一技术扩展到了育种领域.近年来,灭活原生质体融合,离子束细胞融合,非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法相继提出并且应用于微生物育种,这是原生质体融合技术的新发展.1.4代谢控制育种代谢控制育种兴起于20世纪50年代末,以1957年谷氨酸代谢控制发酵成功为标志,并促使发酵工业进入代谢控制发酵时期.近年来代谢工程取得了迅猛发展,尤其是基因组学,应用分子生物学和分析技术的发展,使得导入定向改造的基因及随后的在细胞水平上分析导入外源基因后的结果成为可能【l0].快速代谢控制育种的活力在于以诱变育种为基础,获得各种解除或绕过微生物正常代谢途径的突变4生命科学仪器2009第7卷门2月刊综述株,从而人为地使有用产物选择性地大量生成积累,打破了微生物调节这一障碍.从微生物育种史中可以看出,经典的诱变育种是最主要的育种手段,也是最基础的手段,但它具有一定盲目性,代谢控制育种的崛起标志着育种发展到理性阶段,作 为微生物育种最为活跃的领域而得到广泛的应用,它与杂交育种结合在一起,反映了当代微生物育种的主要趋势.代谢育种在工业上应用非常广泛.Tsuehida等采用亚硝基胍诱变等方法处理乳糖发酵短杆菌2256,最终选出一株L一亮氨酸高产菌,可在13%葡萄糖培养基中积累L一亮氨酸至34g/L.代谢控制育种提供了大量工业发酵生产菌种,使得了氨基酸,核苷酸,抗生素等次级代谢产物产量成倍地提高,大大促进了相关产业的发展.1.5基因工程育种基因工程育种是指利用基因工程方法对生产菌株进行改造而获得高产工程菌,或者是通过微生物间的转基因而获得新菌种的育种方法甚因工程育种是真正意义上的理性选育,按照人们事先设计和控制的方法进行育种,是当前最先进的育种技术[11-12].基因工程育种技术在许多方面都有突破的进展,主要体现以下几方面:(1)目的基因的获得,一般通过化学合成法,物理化学法,鸟枪无性繁殖法,酶促合成法,Norther杂交分析法,eDNA文库筛选法,杂交筛选法等方法获得目的基因;(2)载体的选择,基因工程载体主要是质粒和病毒.载体一般为环状DNA;(3)重组子体外构建;(4)重组载体导人受体细胞;(5)重组体筛选和鉴定,以合适的筛选方法选择具有最佳眭能的突变重组子.通过基因工程方法生产的药物,疫苗,单克隆抗体及诊断试剂等已有几十种产品批准上市;通过基因工程方法已获得包括氨基酸类(苏氨酸,精氨酸,蛋氨酸,脯氨酸,组氨酸,色氨酸,苯丙氨酸, 赖氨酸,缬氨酸等),工业用酶制剂(脂肪酶,纤维素酶,乙酰乳酸脱羧酶及淀粉酶等)以及头孢菌素c等的工程菌,大幅度提高了生产能力;通过基因工程方法改造传统发酵工艺也获得了巨大进展,如氧传递有关的血红蛋白基因克隆到远青链霉菌,降低了对氧的敏感性,在通气不足时,其目的产物放线红菌素产量可提高4倍.2展望随着分子生物学等各项新技术的快速发展,微生物分子育种领域已经得到了快速进展,人类已经可以按照自己意愿对微生物进行改造,使其能更好地为人类造福.工业微生物遗传育种在基因工程,细胞工程,蛋白质工程和酶工程等现代生物技术的基础上,创造出了许多设计巧妙,科技含量高,目的性强,劳动强度低,效果显着的育种方法,为人类获得稳定性好,高产,新种类的工程菌株,开发新药和工业产品,提高产品的产量和质量都提供了有力的保障.相信微生物遗传育种学将得到更加全面发展,将为生产实践提供更多的优良菌株,在各领域发挥更加重要的作用.3小结随着生物技术的不断发展,筛选培育高产,优质,抗逆性强的工业微生物菌株,已经成为工业化生产的首要环节.多年的实践经验证明,由野生型菌株经过坚持不懈的选育,可以提高成百上千倍的产品产量和质量.但是微生物的变异主要来自其遗传物质的突变及重组.突变导致的变异程度一般比重组要小,因此根据实验目的及设备水平制定选育规划开展相关实验,是切合实际的举措.此外,还应加强 一些基础资料的积累.相信微生物遗传育种学会得到更加全面发展,为生产实践提供更多的优良菌株,为人类带来福音!参考文献Ⅲ戴四法,黎观红,吴石金.现代工业微生物育种技术研究进展【JJ.微生物学杂志,2000,20(2~48～50.【2]赵超敏,车振明.工业有益微生物育种技术的研究进展fJ].食品研究与开发,2008,29(2}172—174.【3]张彭湃.微生物菌种选育技术的发展与研究进展『J].生物学教学,2005,30(9~3-5.【4]王付转,梁秋霞,李宗伟,等.吴健诱变和筛选方法在微生物育种中的应用fJ1.洛阳师范学院,2002,2:95～98.[5】冯志华,孙启玲.低能离子注入微生物育种及其机制研究进展fJ].四川食品与发酵,2002,113(2~6～8.[6]吴定,路桂红低能离子注入法诱变微生物育种【JJ.新技术新工艺,2002,123,32~32.【7]汪杏莉,李宗伟,陈林海,等.工业微生物物理诱变育5综述种技术的新进展fJJ.生物技术通报,2007,2:114一l18.【8】房耀维,范琳,牛艳芳.等.丁业微生物育种技术研究进展IJ1.内蒙古师范大学自然科学版,2003,32(2k158-161.【9]李戈,曾会才.诱变在产抗生素微生物育种中的应用进展[J].安徽农业科学,2007,35(4970—971.[10]杨继国,林炜铁,吴军林.代谢工程中基因修饰与基因生命科学仪器2009第7卷门2月刊 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测序的物种中,大熊猫基因组与狗的基因组最接近;数据分析结果同时还进一步支持了大多数科学家所持的"大熊猫是熊科的一个亚种"这种观点,证明了熊科内部各类群的分类情况.据悉,大熊猫基因组精细图这一研究成果,填补了大熊猫基因组及分子生物学研究的空白,将从基因组学的层面上为大熊猫的保护,疾病监控及其人工繁殖提供科学依据.6