粘红酵母delta-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达-应用与环境生物学报

粘红酵母∆12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达收稿日期Received:接受日期Accepted:资助：国家自然科学基金项目(No.31160016)，云南省应用基础研究基金资助项目(No.KKSA201126005)、教育部回国人员科研启动基金(No.KKQA201226003)资助.SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(31160016),theApplicationandBasicResearchFundofYunnanProvince(KKSA201126005),theScientificResearchFoundationforReturnedOverseasChineseScholars,StateEducationMinistryofChina.(KKQA201226003)**通讯作者Correspondingauthor(E-mail:qzhang37@gmail.com)杨晓霞，何仕武，魏云林，林连兵，季秀玲，张琦**昆明理工大学生命科学与技术学院昆明650500摘要Δ12-脂肪酸脱氢酶一般特异性在18C油酸第12碳原子引入双键转变成亚油酸。为了从粘红酵母YM25079中克隆全长Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列，本研究参考已知的Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列设计基因特异性引物，通过PCR扩增获得到全长为1353bp的cDNA序列，序列分析结果表明该序列具有一个编码450个氨基酸的一个完整开放阅读框，所编码蛋白质的大小为50.9KD。与报道的Δ12-脂肪酸脱氢酶一样，推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区，表明该序列为一个新的编码Δ12-脂肪酸脱氢酶的基因。为了验证其功能，把开放阅读框序列亚克隆到表达载体pYES3/CT，构建重组表达载体pYRGD12，并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达。通过脂肪酸气相色谱(GC)分析表明，该序列所编码的蛋白质具有Δ12-脂肪酸脱氢酶活性，能将油酸转化为亚油酸，亚油酸的含量占酵母总脂肪酸的4.31%。关键词粘红酵母；Δ12-脂肪酸脱氢酶；亚油酸；克隆和表达CLCQ933CloningandheterologousexpressionofaΔ12-desaturasegenefromRhodotorulaglutinis*YANGXiaoxia,HEShiwu,WEIYunlin,LINLianbing,JIXiuling&ZHANGQi**FacultyofLifeScienceandTechnology,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,ChinaAbstractObjectives:∆12-fattyaciddesaturasegenerallyintroducesanewdoublebondspecificallyatΔ12positionof18Coleicacidtogeneratelinoleicacid.Thisstudyistoclonethefull-length∆12-fattyaciddesaturasegenefromRhodotorulaglutinisstrainYM25079.Methods:Basedonthesequenceinformationoftheknownyeast∆12-fattyaciddesaturasegenes,apairofspecificprimerswasdesignedandusedfortheamplificationofYM25079∆12-fattyaciddesaturasegene.TheobtainedsequencewasfurthertransformedintoSaccharomycescerevisiaestrainINVSclforfunctionalanalysis.Results:Afull-lengthcDNAsequenceof1353bpwasamplifiedfromRhodotorulaglutinisYM25079.Sequenceanalysisshowedthissequencecomprisedanopenreadingframeencoding458aminoacidsof50.9KD.Thededucedamino-acidsequenceshowedsimilaritytotheknown∆12-fattyaciddesaturaseswhichcomprisethreecharacteristicconservedhistidine-richregionsforthemembrane-bounddesaturases,indicatingthiscDNAsequenceisanovel∆12-fattyaciddesaturasegene.ThesequencewasfurtherclonedintotheexpressionvectorpYES3/CTtogeneratearecombinantplasmidpY3RGD12,whichwassubsequentlytransformedintoSaccharomycescerevisiaestrainINVSclforheterologousexpression.Totalfattyacidsanalysisofthetransformed yeastcellsbygaschromatography(GC)showedthatanovelpeakcorrespondingtothestandardsoflinoleicacidmethylesterwasdetectedwiththesameretentiontime,whichwasabsentinthecelltransformedwithemptyvector.Theratioofthisnewfattyacidtototalfattyacidswas4.31%.Conclusion:ThePCR-amplifiedsequencewhosecodingproductexhibited∆12-fattyaciddesaturaseactivitytoconvertspecificallyoleicacidtolinoleicacidisanovel∆12-fattyaciddesaturasegene.KeywordsRhodotorulaglutinis;∆12-fattyaciddesaurasegene;linoleicacid;cloningandexpression多不饱和脂肪酸（Polyunsaturatedfattyacids,PUFAs）是指含有两个或两个以上双键、碳原子数为18～22的直链脂肪酸[1]。很多研究表明，诸如花生四烯酸AA（ArachidonicacidARA,20:4n-6）、二十碳五烯酸EPA（Eicosapentaenoicacid,C20:5n-3）和二十二碳六烯酸DHA（Docosahexaenoicacid,22:6n-3）等长链多不饱和脂肪酸是细胞膜的重要组成成分，同时也是动物和人体中激素类（Hormone-like）生物活性物质的前体，在细胞膜的结构和功能调节、抗肿瘤抗炎、促进细胞生长、防止心脑血管疾病、有利于大脑视网膜形成、免疫调节和基因表达等很多重要的生理调节功能[2,3]。PUFAs广泛存在于各种生物中，其合成是从18C的饱和脂肪酸合成途径上扩展的，在真核生物中饱和的硬脂酸（Stearicacid）经过∆9-脂肪酸脱氢酶的催化转化成油酸（Oleicacid,OA），然后经∆12-脂肪酸脱氢酶的催化进一步转化成亚油酸（Linoleicacid,LA），后者进一步进入n-3和n-6途径在不同脂肪酸脱氢酶（Fattyaciddesaturease）和延长酶（Elongase）交替催化下，合成各种不同的PUFAs，因此∆12-脂肪酸脱氢酶催化合成LA是PUFAs合成关键步骤[4,5]。自首次从耐冷的蓝细菌（Synechocystissp.）PCC6803中克隆到∆12-脂肪酸脱氢酶基因[6]以来，已经从不同植物、动物和微生物中分离到很多类似的功能基因序列，功能分析结果表明∆12-脂肪酸脱氢酶主要功能是在油酸（∆9）的第12和13位碳原子之间插入一个双键，形成含有2个双键的亚油酸（∆9,12），具有底物链长特异性[7]。但是，近年来对一些真菌和原生动物来源的∆12-脂肪酸脱氢酶体外功能验证结果表明，该酶没有底物链长特异性，而是具有多功能特点[8]。比如线虫（Caenorhabditiselegans）∆12-脂肪酸脱氢酶CeFAT-2具有双功能的Δ12/Δ15-脂肪酸脱氢酶活性，而且脂肪酸底物的碳链长度可在C14到C18范围内[9]。高山被孢霉（Mortierellaalpina）IS-4中的ω3-脂肪酸脱氢酶（MAW3）也被证明具有三功能的Δ12/Δ15/ω3-脂肪酸脱氢酶，其对不同类型的脂肪酸底物具有不同的脱氢活性[10]。我们前期的研究结果表明，粘红酵母（Rhodotorulaglutinis）YM25079随着培养温度下降，细胞中PUFAs合成增加，维持了细胞膜的流动性和基本功能，而且PUFAs合成增加与粘红酵母YM25079中潜在的∆12-脂肪酸脱氢酶基因的mRNA表达水平的提高有关[11]。在此基础上，本研究从YM2079中克隆∆12-脂肪酸脱氢酶基因的全长编码序列并在酿酒酵母中进行功能验证，这将有助于丰富脂肪酸脱氢酶基因资源，阐明菌株中PUFAs合成的相关生化途径，同时了解低温条件下YM25079中PUFAs合成的调节机制以及通过遗传学手段在粘红酵母中或者其它细胞中合成特定的PUFAs，为将来的相关研究打下基础。1材料和方法1.1菌株和质粒粘红酵母（Rhodotorulaglutinis）YM25079、大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α由本室保藏，克隆载体pMD18-T购自宝生物工程（大连）有限公司，酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）菌株INVScl和表达载体pYES3/CT购自Invitrogen公司。1.2试剂所用DNA限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司，DNA分子量标准和高保真DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司产品，细胞总RNA提取和反转录试剂盒购自Promega公司，脂肪酸甲酯标准品购自Sigma公司。1.3∆12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆从培养48h的粘红酵母YM25079中提取提取总RNA，按反转录试剂盒说明书取1μg总RNA为模板 进行反转录合成第一条cDNA，冻存于-20℃备用。同时，基于已获得的部分序列的相似性搜索结果，以NCBIGenbank中粘红酵母（Rhodotorulaglutinis）菌株ATCC204091、圆红冬孢酵母（Rhodosporidiumtoruloides）菌株NP11潜在的∆12-脂肪酸脱氢酶基因序列作为参考，设计合成引物对进行PCR扩增，上游引物为：5`-ATAAGCTTATGGCCGCTACCCTCCGCCAGC-3`（下划线部分为HindIII位点），下游引物为RDD12R：5`-ATGAATTCCTAGAGTCCCTCGACGCCCGAGT-3`（下划线部分为EcoRI酶切位点）。PCR扩增条件为：94℃变性2min,然后按94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环，最后72oC10min。将PCR产物回收并克隆到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定阳性克隆，挑取正确的阳性克隆进行测序。1.4∆12-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达1.4.1表达质粒pYRGD12的构建将PCR产物和表达载体分别用HindIII和EcoRI双酶切、回收、连接并转化大肠杆菌DH5α。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、载体构建和转化、重组质粒的鉴定均按常规方法进行，所得重组质粒命名为pYRGD12。1.4.2酿酒酵母细胞的转化和诱导表达按文献[12]的方法，通过LiAc方法将pYRGD12和空载体pYES3/CT分别转化感受态的酿酒酵母INVScl菌株，28℃培养72h后挑取SC-Ura（无尿嘧啶）选择培养基平板上生长的转基因酵母，接种于5mlSC-Ura选择性液体培养基中（含2%的棉籽糖或葡萄糖），28℃过夜培养；以5%的接种量加入含有1%NP-40、2%棉子糖的100mlSC-Ura培养基，28℃继续培养，等酵母细胞的密度达到OD=0.2~0.3时加入2%半乳糖诱导，再转入20℃培养72h，然后2500rpm收集菌体，用去离子水洗涤三次，50℃烘干，研碎。1.5脂肪酸气象色谱分析参照文献[11]的方法，取100mg干菌粉加入5ml5%的KOH-CH3OH溶液中，70℃反应3-5h。冷却到室温后，用6mol/L的盐酸调节溶液的pH值为2.0，加入4ml14%BF3（BF3/乙醚）-CH3OH溶液，70℃继续反应1.5h，合成脂肪酸甲酯。再加入饱和的NaCl溶液10ml，充分混匀后转移到分液漏斗中。用8ml1:4的氯仿:己烷抽提两次，合并提取液，然后加入适量无水Na2S2O8干燥提取液，静置1h，过滤去除Na2S2O8，用氮气将含有脂肪酸甲酯的滤液吹干，然后用正己烷回溶，最后以亚油酸甲酯标准品最为对照，进行GC分析，测定pYRGD12转基因酵母中LA的合成。2结果2.1全长cDNA序列扩增图1粘红酵母YM25079Δ12-脂肪酸脱氢酶基因的PCR扩增。1：DNA分子量标记DL2000；2：PCR扩增产物。Fig.1PCRamplificationofRhodotorulaglutinisYM25079∆12-desaurasegene.1:DNAMarkerDL2000;2PCRproduct 以总RNA反转录产物作为模板，利用参考NCBIGenbank中粘红酵母ATCC204091和圆红冬孢酵母NP11潜在的∆12-脂肪酸脱氢酶基因序列设计的引物进行PCR扩增，获得大小为1.4kb的片段（图1）。将片段进行回收，连接到pMD18-T载体上并转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和菌落PCR验证，挑取正确的阳性克隆送出测序。1ATGGCCGCTACCCTCCGCCAGCGCACCGCCGCCGCCGCGCCCCGCAAGGAGAAGGAGCACGACGTCCTCGCG1MAATLRQRTAAAAPRKEKEHDVLA73TCGTCCGACTCGGAGGAGGAGCACCAGGACCCGCTCAAGGCGCTCGAGAACGAGTACCCGCCGTTCGTCGTG25SSDSEEEHQDPLKALENEYPPFVV145CCCAACCTCACCATCAAGGAGGTCCTCGGCGCCATCCCGGCCAAGTGCTTCGAGCGCTCGGCCCTGCGCTCG49PNLTIKEVLGAIPAKCFERSALRS217TCGACCTACGTCGTCGGCGACTTCCTCATGGTCGCTGCCCTCGGCTATGCCGCGTACCACATCGACCCGGCC73STYVVGDFLMVAALGYAAYHIDPA289TTCTCGTACACGGGCGGCAAGCACCTCGACGGCTGGGCCGGGTTCGCCGCCAAGTGGGCCGCCTGGAGCCTG97FSYTGGKHLDGWAGFAAKWAAWSL361TACTGGACCCTCCAGGGCTGGGTCATGACCGGCATCTGGATCCTCGGTCACGAGTGCGGCCACCAGGCGTTC121YWTLQGWVMTGIWILGHECGHQAF433TCGACGTCCAAGACGATCAACAACACGATGGGCCTGTTCCTCCACTCGTTCGTCCTCGTGCCGTATCACTCG145STSKTINNTMGLFLHSFVLVPYHS505TGGCGCATCTCGCACGCCAAGCACCACGCCGCCACCGGTCACCTCACGCGCGATGAGGTGTTCGTGCCCCGC169WRISHAKHHAATGHLTRDEVFVPR577ACCAAGTCGACCCGCAACCCCAAGCCGACGGGCAAGAAGCTCGAGGTGTCGCGCAACGTCGAGATCGACGAG193TKSTRNPKPTGKKLEVSRNVEIDE649CTCCTCGAGGACGCGCCCGTGTACCGCCTCGGGTGGATCCTCGTCCAGCAGCTGTTCGGCTGGCCCGCCTAC217LLEDAPVYRLGWILVQQLFGWPAY721CTGTTCACCAACGCGTCCGGCCAGCTGTGGTACCCCAAGTGGACCAACCACTTCGACCCGTCGTCGCTCGTG241LFTNASGQLWYPKWTNHFDPSSLV793TTCGACGCCCGCCACCGCAACCAGGTCCTCATCTCGGACGCGTTCCTCGTCGGCATGGTCGGCCTCCTCACC265FDARHRNQVLISDAFLVGMVGLLT865CTGTTCGGCTCGGTCATGGGCGGCTTCTCGGCCGTCACCAAGTACTACCTCGTGCCGTACCTCCTCGTCAAC289LFGSVMGGFSAVTKYYLVPYLLVN937CACTGGCTCGTCATGATCACGTACCTCCAGCACACGGACCCTCAGCTGCCGCACTACTCGGCCGACATGTGG313HWLVMITYLQHTDPQLPHYSADMW1009AACTTCCAGCGCGGCGCCCTGTGCACCATCGACCGCAACCTCCTCGGTCCCGTCGGCCCGTACCTCATGCAC337NFQRGALCTIDRNLLGPVGPYLMH1081GGCATCACCGAGACGCACGTCGCCCATCACATCTCGTCCAAGATCCCGCACTACCACGCCTGGGAGGCGACC361GITETHVAHHISSKIPHYHAWEAT1153GAGGCGCTCAAGTCGTTCCTCGGCGAGCACTACCACGCGACCGACGAGAACATGTTCGTCTCGCTGTGGAAG385EALKSFLGEHYHATDENMFVSLWK1225GGCTACAAGCAGTGCCGCTACGTCGAGGACGAGGGCCCCGTCCTGTTCTACAAGGACGCGTACGGTCGCGCT409GYKQCRYVEDEGPVLFYKDAYGRA1297CGCCGCAACTACGTCCTCCCCGACGTTCCCTCCGACTCGGGCGTCGAGGGACTCTAG433RRNYVLPDVPSDSGVEGL*图2YM25079Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列及其编码的氨基酸序列。灰色背景表示三个组氨酸保守区。Fig.2cDNAsequenceanddeducedaminoacidsequenceofYM25079Δ12-desaurasegene.Graybackgroundsindicatethethreeconservedhistidine-richmotifs 图3推测的粘红酵母YM25079∆12-脂肪酸脱氢酶和粘红酵母(ATCC204091RGD12)、圆红冬孢酵母(NP11RTD12)和高山被孢霉IS-4(IS-4MAD12)的∆12-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列序列比对。黑色表示相同氨基酸，下划线表示三个组氨酸保守区。Fig.3SequencealignmentofdeducedaminoacidsoftheRhodotorulaglutinis∆12-desaurasewiththe∆12-desauraseofRhodotorulaglutinis(ATCC204091RGD12),Rhodosporidiumtoruloides(NP11RTD12)andMortierellaalpine(IS-4MAD12).Blackbackgroundsindicateidentityofaminoacidresidues.Thethreeconservedhistidine-richmotifsareunderlined.2.2序列分析 测序结果表明，PCR扩增获得1353bp的cDNA序列，编码450个氨基酸（图2）。将所推测的氨基酸序列和已知真菌的Δ6-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列进行比较，结果显示氨基酸序列具有膜整合酶特异性的组氨酸保守区HECGH（HisI区，氨基酸位点37~41）、HAKHH（HisII区，氨基酸位点73~77）和HAVHH（HisIII区，氨基酸位点366~-370）（图2、3），该序列编码的氨基酸序列与未经功能验证的圆红冬孢酵母NP11Δ12-脂肪酸脱氢酶（Genbank编号EMS18237）和粘红酵母ATCC204091Δ12-脂肪酸脱氢酶（Genbank编号EGU10893）的相同性（Identity）最高，分别为83.63%和83.41%，但是与已报道的Δ12-脂肪酸脱氢酶相似性最高为深黄被孢霉IS-4的Δ12-脂肪酸脱氢酶[4]（Genbank编号AAF08684），相同性为42.79%，表明所获得的cDNA序列为一个新的潜在Δ12-脂肪酸脱氢酶基因。2.3重组表达质粒pY3RGD12的构建把目的基因连接到表达载体pYES3/CT上构建重组质粒pY3RGD12（图4A），经菌落PCR验证后提取重组质粒，用HindIII和EcoRI进行双酶切分析，结果表明重组质粒酶切产生1.4kb和5.9kb的两条带（图4B第3泳道），两条带分别与目的基因片段和空载体酶切后的大小一致，初步表明构建成功，同时将酶切验证正确的质粒送出进一步进行测序验证。B图3推测的粘红酵母YM25235∆12-脂肪酸脱氢酶和粘红酵母ATCC、圆红冬孢酵母NP11和高山被孢霉IS-4的∆12-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列序列比对Fig.3SequencealignmentofdeducedaminoacidsoftheRhodotorulaglutinis∆12-desaurasewiththe∆12-desauraseofRhodotorulaglutinis(ATCC204091RGD12),Rhodosporidiumtoruloides(NP11RTD12)andMortierellaalpine(IS-4MAD12)Blackbackgroundsindicateidentityofaminoacidresidues.Thethreeconservedhistidine-richmotifsareunderlined.A图4重组质粒pY3RGD12的构建。A：重组质粒pY3RGD12质粒图谱；B：重组质粒pY3RGD12限制性酶切分析，1：DNA分子量标准DL5000,2:PCR产物，3：HindIII和EcoRI双酶切pY3RGD12，4：HindIII和EcoRI双酶切pYES3/CT。Fig.4ConstructionofrecombinantplasmidpY3RGD12.A:MapofRecombinantplasmidpY3RGD12;B:RestrictiveanalysisofpY3RGD12,1:DNAmarkerDL5000,2:PCRproduct,3:pY3RGD12digestedbyHindIIIandEcoRI,4:pYES3/CTdigestedbyHindIIIandEcoRI.2.4粘红酵母YM25079∆12-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的诱导表达表1不同质粒转化的酿酒酵母脂肪酸含量Tab.1FattyacidcompositionoftotallipidfromyeasttransformantscontainingpYES3/CTandpYESRGD12TransformantFattyacidcomposition(%)C14:0C16:0C16:1C18:0C18:1OAC18:2LApYES3/CT0.7921.5733.539.7133.740pY3RGD120.6220.9833.598.9530.274.31将经验证正确的重组质粒转入酿酒酵母INVScl中进行功能表达，经半乳糖诱导，提取细胞总脂肪酸并进行甲酯化，以亚油酸甲酯标准品、空载体pYES3/CT转化的酵母菌INVScl作为对照进行GC分析，转化空载体对受体菌株INVScl的脂肪酸组成和含量没有影响，因此通常用来做阴性对照。如图5B所示，只有转化了pY3RGD12的酵母工程菌株中产生保留时间为13.8 min的特殊峰（黑色箭头所示），含量占总脂肪酸的4.31%（表1），与亚油酸甲酯标准品的保留时间一致，而在对照样（图5A）中没有出现相应的峰，对该新峰的质谱分析结果也证明其为亚油酸甲酯。这些结果表明扩增获得的目的基因所编码的酶具有∆12-脂肪酸脱氢酶的活性，能利用内源性油酸作为底物合成亚油酸。ADetectorResponseDetectorResponseB图5转基因酿酒酵母总脂肪酸的气相色谱分析图。A：pYES3/CT转化的酵母;B：pY3RGD12转化的酵母。Fig5GCanalysisoffattyacidsintransgenicSaccharomycescerevisiae.A:SaccharomycescerevisiaetransformedwithpYES3/CT;B:SaccharomycescerevisiaetransformedwithpY3RGD12.3讨论脂肪酸脱氢酶(fattyaciddesaturase)催化脂肪酸链上特定的位点脱氢形成双键，在生物体内对脂肪酸代谢、维持膜的正确结构和生物学功能方面起着重要的作用[5,13]。脂肪酸脱氢酶一般具有特征性的3个保守的组氨酸富集区HisI（HXXXH）、HisII（HXXHH）和HisIII（HXXHH）[14]，除了植物质体中∆9-脂肪酸脱氢酶是可溶性的外，其余都是膜结合的脂肪酸脱氢酶，其中 微体膜脂肪酸脱氢酶按其引入双键的方式不同又可以分为两种，一种是甲基定向的脂肪酸脱氢酶，催化已有的双键和甲基之间形成另一个双键，另一种是羧基定向的脂肪酸脱氢酶,催化已有的双键和羧基之间形成另一个双键，而且N端还有一个类似于细胞色素b5(Cytb5)的血红素结合区HPGG[5,13]。氨基酸序列分析显示，我们获得的cDNA编码的氨基酸序列中具有三个典型的组氨酸保守区HECGH（HisI区，氨基酸位点37~41）、HAKHH（HisII区，氨基酸位点73~77）和HAVHH（HisIII区，氨基酸位点366~-370），分布位点以及保守区之间氨基酸数目均和已知的∆12-脂肪酸脱氢酶类似，而且N端也没有类似于细胞色素b5的血红素结合区HPGG序列存在（图2、3），因此该氨基酸序列属于甲基端定向的脂肪酸脱氢酶，NCBI相似性搜索结果也表明与酵母和丝状真菌的∆12-脂肪酸脱氢酶的相似性最高，初步表明该cDNA序列为一个新的潜在的∆12-脂肪酸脱氢酶基因。∆12-脂肪酸脱氢酶属于膜整合蛋白，和其它大多膜蛋白一样，目前还没有该酶的分离纯化和体外活性分析的报道，因此脱氢酶的活性只能通过检测脂肪酸组成变化来测定。为了验证所获得基因的功能，我们将其转入酿酒酵母中，结果证明该基因编码产物将内源性油酸转化成亚油酸（图5），因此我们获得cDNA序列是一个新的∆12-脂肪酸脱氢酶基因。此外，近年来对一些真菌和原生动物来源的∆12-脂肪酸脱氢酶基因体外功能验证表明，该酶具有多功能特点[8,9,10]。粘红酵母YM25079能合成亚油酸和α-亚麻酸（α-linoleicacid），表明其具有Δ12和Δ15-脂肪酸脱氢酶，但是在我们前期尝试分离独立的Δ15-脂肪酸脱氢酶基因，一直没有取得进展，因此本研究所获得的基因编码的蛋白是否也具有双功能的Δ12/Δ15-脂肪酸脱氢酶活性将有待于进一步分析。由于脂肪酸脱氢酶可以用于微生物代谢工程进行工业化生产PUFAs和其它有价值的不饱和脂肪酸，极大促进了对真菌来源的脂肪酸脱氢酶的研究[15]。一些产油酵母（Oilyyeasts）能在细胞累积油脂占其干重的20%，在已发现的酵母中大约5%的种类能累积25%以上细胞油脂，包括亚罗酵母属（Yarrowia）,假丝酵母属（Candida）,红酵母属（Rhodotorula）,红冬孢酵母属（Rhodosporidium）,隐球酵母属（Cryptococcus），毛孢子菌属（Trichosporon）和油脂酵母属（Lipomyces）等一些菌株[16]。产油酵母中油脂的成分与常见的植物油相类似，油脂的生物化学和物理化学性质独特明确，作为商业化膳食性PUFAs的来源以及生物柴油原料的开发和研究已逐渐成为研究的热点，而且近十年来越来越多的研究集中于酵母油脂合成生化途径的阐明上[17]。因此，本研究以筛选自泸沽湖水的一株产油酵母－粘红酵母YM25079作为研究对象，对其PUFAs合成相关基因进行分离鉴定，有助于丰富脂肪酸脱氢酶基因资源，阐明YM25079中PUFAs合成的相关生化途径，为进一步利用粘红酵母或者相关基因生产特定的PUFAs打下基础。此外，虽然通过基因组解析从一株粘红酵母ATCC204091也发现一潜在的∆12-脂肪酸脱氢酶基因序列[18]，但是该序列和本研究获得全序列并不相同，而且目前也未见从不同粘红酵母中克隆表达∆12-脂肪酸脱氢酶基因的研究报道。粘红酵母YM25079∆12-脂肪酸脱氢酶基因已上载到NCBIGenbank，序列编号为KJ502672。参考文献[References]1.张琦,王志,何仕武,季秀玲,林连兵,魏云林.多不饱和脂肪酸对微生物低温适应性的影响[J].生命科学.2012,24(1):58-63.[ZhangQ,WangZ,HeSW,JiXL,LinLB,WeiYL.EffectsofpolyunsaturatedfattyacidsonthecoldadaptationofMicrooganisms[J].ChineseBulletinofLifeSciences.2012,24(1):58-63]2.GillI,ValivetyR.Polyunsaturatedfattyacids,part1:occurrence,biologicalactivitiesandapplications[J].Trendsbiotechnol,1997,15(10):401-409.3.BureauDP,HuaK,HarrisAM.Theeffectofdietarylipidandlong-chainn-3PUFAlevelsongrowth,energyutilization,carcassquality,andimmunefunctionofrainbowtrout,Oncorhynchusmykiss[J].JWorldAquaculSoc,2008,39(1):1-21.4.SakuradaniE,KobayashiM,AshikariT,ShimizuS.IdentificationofΔ12-fattyaciddesaturasefromarachidonicacid-producingMortierellafungusbyheterologousexpressionintheyeastSaccharomycescerevisiaeandthefungusAspergillusoryzae[J].EurJBiochem,1999,261(3):812-820.5.MeesapyodsukD,QiuX.Thefront-enddesaturase:structure,function,evolutionandbiotechnologicaluse[J].Lipids,2012,47(3):227-237.6.WadaH,CombosZ,MurataN.Enhancementofchillingtoleranceofacyanobacteriumbygeneticmanipulationoffattyacid 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